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Normes du site d'intégration lentivirale
Arrière-plan
L'immunothérapie par cellules T à récepteurs d'antigènes chimériques (CAR-T) est une méthode de traitement personnalisée qui utilise la technologie de modification génétique pour préparer des lymphocytes T exprimant des récepteurs d'antigènes chimériques (CAR), qui sont développés in vitro puis réinjectés dans le corps du patient.
Ces dernières années, avec le lancement de produits de thérapie cellulaire tels que Kymriah, Yescarta et Strimvelis, le lentivirus est un vecteur intermédiaire clé dans le processus de chargement cellulaire du CAR. Garantir la qualité et la sécurité des médicaments à base de lentivirus constitue un défi de taille. À la fin de l'année dernière, la FDA a annoncé une enquête sur les problèmes de sécurité de la thérapie CAR-T - l'émergence de risques de cancer des cellules T serait due au vecteur de délivrance de gènes utilisé - le vecteur lentiviral. Le 31 janvier de cette année, les lignes directrices « Considérations pour le développement de produits à cellules T à récepteurs d'antigènes chimériques (CAR) » ont été officiellement publiées. Il est recommandé de déterminer la norme de publication du numéro de copie vectorielle (VCN) en fonction de l'évaluation des risques. L'évaluation des risques comprend des données expérimentales étayées par des recherches telles que l'analyse du site d'insertion, l'avantage clonal, la dose, l'indication et la population étudiée.
Les « Recherche non clinique et directives techniques pour les produits de thérapie cellulaire génétiquement modifiées » publiées par le Centre d'approbation des médicaments de la National Medical Products Administration (CDE) comprennent également « l'évaluation du risque de mutation par insertion » dans le cadre de la recherche non clinique sur la sécurité et précisent en détail les points d'évaluation des principaux facteurs de risque. Par conséquent, la thérapie CAR-T doit évaluer les risques potentiels de mutations par insertion et de cancérogénicité.
Introduction
En 2021, mon pays a publié quatre lignes directrices consécutives pour les produits liés à la thérapie génique, qui soulignaient toutes que la détection de l'intégration lentivirale devrait au moins inclure 1. Direction d'intégration 2. Position d'intégration 3. Nombre absolu de clones à une position d'intégration et une direction d'intégration spécifiques.
En réponse à cette exigence, CB-Gene lance désormais des normes de sites d'intégration lentivirales.
Le site d'insertion lentivirale a été déterminé sur la base des résultats NGS (séquençage de sonde de capture) et a été revérifié par séquençage Sanger et ddPCR pour localiser avec précision le site d'insertion lentivirale et la fréquence d'intégration.
Service de détection de sites d'intégration lentivirale
CB-Gene propose désormais un service de détection des sites d'intégration lentivirale (technologie de séquençage par sonde de capture). La technologie de séquençage de sonde de capture effectue principalement la capture de sonde sur la région LTR, et après PCR, la vérification du séquençage NGS est effectuée et combinée avec des méthodes d'analyse bioinformatique, le site d'insertion lentivirale est déterminé. Par la suite, les méthodes Sanger et ddPCR ont été utilisées pour vérifier la technologie NGS (Capture Probe Sequencing). Les sites détectés par NGS (séquençage de sonde de capture) ont été détectés par les méthodes Sanger et ddPCR.
| Nom | Description |
| Technologie de séquençage des sondes de capture | Analyse des sites d'intégration lentivirale |
Le service de détection du site d’insertion du lentivirus (séquençage de sonde de capture) peut vous aider à localiser avec précision le site d’insertion du lentivirus. La norme du site d'intégration des lentivirus peut non seulement être appliquée à diverses méthodes de détection pour vous aider à déterminer l'exactitude de la méthode, mais peut également être utilisée pour localiser la limite de détection de la méthode de détection.
Caractéristiques de l'intégration des lentivirus
Le lentivirus est actuellement la méthode de transduction principale pour le CAR-T (environ 90 % des produits CAR-T approuvés par la FDA utilisent le LV). L'intégration des lentivirus dans les cellules est semi-aléatoire (préférant les régions transcriptionnellement actives).
1. Le lentivirus reconnaît les récepteurs de la surface de l'hôte et transporte l'ARN et les protéines dans les cellules ;
2. L'ARN viral est transcrit de manière inverse pour former un ADNc double brin linéaire (y compris des séquences LTR aux deux extrémités)
3.Integrase reconnaît le LTR et l'ADNc est intégré dans le génome de l'hôte ;
4.Les gènes exogènes continuent d’être exprimés à mesure que les cellules hôtes se divisent.
Application du lentivirus à la thérapie cellulaire CAR-T
Le lentivirus est largement utilisé en thérapie cellulaire en raison de ses caractéristiques :
1. Large gamme d'infections, haute efficacité, infection efficace des cellules en division et sans division ;
2.forte stabilité, intégration dans le génome, expression stable à long terme des gènes exogènes ;
3.faible immunogénicité et sécurité relativement élevée.
