Question 1 de CB-Gene : On pense généralement qu'au cours de cette étape de construction, le FRT s'intégrera dans la région transcriptionnellement active de la cellule. Cela signifie que pour l'expression ultérieure du gène cible exogène recombinant, cette étape d'intégration fournit un certain degré d'assurance pour la surexpression de la protéine exogène.
Pour des lieux d'intégration spécifiques, veuillez consulter notre service ISS (Integration Site Search).
Question 2 de CB-Gene : Dans un protocole de transfection plasmidique classique, combien de copies peuvent être intégrées dans la cellule hôte ? Quel est le nombre optimal de copies ? De manière générale, lors de la construction de cellules mères Flp-FRT, l'intégration se produit de manière aléatoire après la transfection, ce qui signifie que plusieurs copies seront intégrées à différents emplacements chromosomiques de la cellule hôte. Plus il y a de copies intégrées, plus le gène cible est susceptible d'être recombiné et intégré, indiquant une expression plus élevée. Cependant, lors de la recombinaison du gène cible, l'efficacité d'intégration de plusieurs copies peut ne pas être de 100 %, ce qui entraîne des clones mixtes (niveaux d'expression incohérents entre les clones). Parfois, pour les protéines cibles qui ne nécessitent pas une expression élevée, Kebai recommande de sélectionner des clones avec une seule copie intégrée. De cette façon, tout clone qui réussit le dépistage de la résistance est, en principe, un clone unique, éliminant ainsi la nécessité de limiter le clonage par dilution.
Pour la détection du numéro de copie, veuillez consulter notre service de détection dPCR.
CB-GeneCellules ponctuelles Flp-FRT internes de
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2. Intégration du gène cible :
Un vecteur d'expression contenant le gène cible et un vecteur d'expression contenant la recombinase Flp sont co-transfectés dans les cellules issues de l'étape 1. La recombinase Flp assure la médiation d'une recombinaison spécifique à un site entre les sites FRT dans le génome hôte et ceux dans le vecteur d'expression, réalisant l'intégration du gène cible et permettant une expression stable sous le contrôle du promoteur.
Transporteur 1 :
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Surexpression de la recombinase Flp, aucune résistance requise, aucune intégration stable requise
Transporteur 2:
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Contient le gène cible et un deuxième marqueur de sélection du gène de résistance
Processus de réorganisation ：
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Formation finale ：
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Après recombinaison, des cellules positives peuvent être sélectionnées via le deuxième gène de résistance, et les cellules sont tolérantes au gène de résistance-2 et sensibles au gène de résistance-1.
