Services de tests q-PCR

La PCR quantitative en temps réel (qPCR) intègre des colorants ou des sondes fluorescentes dans le système de détection PCR. En mesurant l'intensité de la fluorescence à chaque cycle d'amplification, la qPCR permet une surveillance en temps réel de l'accumulation de produits de PCR, permettant à la fois une détection qualitative et une analyse quantitative de la matrice d'acide nucléique initiale. Au fur et à mesure de l’amplification, les produits PCR fluorescents s’accumulent proportionnellement, générant une courbe d’amplification caractéristique.
 

Une courbe d'amplification PCR en temps réel typique se compose de trois phases : ligne de base, exponentielle et plateau.
 

Ligne de base : pendant cette phase, le signal de fluorescence reste aux niveaux de fond et ne peut pas être distingué de manière fiable du bruit.
 

Exponentiel : le signal de fluorescence s'élève au-dessus du fond et augmente de façon exponentielle. Le nombre de cycles auquel le signal de fluorescence franchit un seuil défini est appelé valeur Ct (Cycle Threshold). Le logarithme de la concentration initiale du modèle est linéairement corrélé à la valeur Ct, constituant la base de l'analyse quantitative.
 

Plateau : Dans cette phase, l’efficacité de l’amplification diminue et l’accumulation de produits atteint des plateaux. Par conséquent, la quantité finale de produit PCR ne reflète plus la concentration initiale de la matrice et ne peut pas être utilisée pour une quantification précise.

La quantification par qPCR peut être effectuée à l'aide de stratégies de quantification absolues ou relatives, généralement mises en œuvre avec les tests à base de colorant SYBR Green I ou les tests basés sur la sonde TaqMan.

Quantification absolue : La quantification absolue, également connue sous le nom de méthode de la courbe standard, détermine la quantité initiale d'un modèle cible dans un échantillon inconnu par comparaison avec une courbe standard. Une série d'étalons préparés par dilution en série de 5 à 6 points (CoBioGene propose une large gamme d'étalons validés) sont amplifiés à l'aide d'une PCR quantitative en temps réel. Une courbe standard est générée en traçant le logarithme du numéro de copie initial du modèle cible sur l'axe des x par rapport aux valeurs Ct (seuil de cycle) correspondantes sur l'axe des y. Une équation de régression linéaire est ensuite établie et la valeur Ct de l'échantillon inconnu est appliquée à cette équation pour calculer la quantité de départ du modèle cible.

Quantification relative : la quantification relative mesure les changements dans l'expression des gènes en comparant l'abondance d'un gène cible entre différents échantillons, entre différentes régions du même échantillon ou à différents moments expérimentaux. Cette méthode implique généralement une normalisation par rapport à un gène de référence et peut également être utilisée pour analyser le rapport du nombre de copies d'un gène cible par rapport à un contrôle endogène au sein du même échantillon.

Théoriquement, il peut détecter aussi peu que quelques copies de molécules d’acide nucléique.

En utilisant notamment la méthode de la sonde TaqMan, il peut distinguer efficacement des séquences hautement homologues et des polymorphismes mononucléotidiques (SNP).

Fournit des résultats numériques avec une large plage dynamique (couvrant 7 à 8 ordres de grandeur).

Le format de plaque à 96 ou 384 puits permet de tester simultanément un grand nombre d'échantillons, ce qui se traduit par une efficacité extrêmement élevée.