Lignées cellulaires stables intégrées par électroporation plasmidique
Définition
L'électroporation, également connue sous le nom d'électroperméabilisation, est une méthode d'administration non virale très efficace pour introduire des acides nucléiques (ADN ou ARN), des protéines, des médicaments et d'autres molécules dans les cellules. Des impulsions électriques courtes et contrôlées perméabilisent de manière transitoire la membrane cellulaire, permettant l'absorption de ces molécules.
Après l'électroporation, l'ADN plasmidique peut rester épisomique (non intégré) ou, selon la conception expérimentale, s'intégrer dans le génome hôte, entraînant une expression transitoire ou stable.
Principe de fonctionnement
Lors de l'électroporation in vitro, une suspension de cellules cibles et l'ADN plasmidique à introduire dans les cellules sont mélangés dans une solution conductrice et placés dans une cuvette (Figure 1). La chambre à échantillon de la cuvette d'électroporation comporte deux plaques métalliques de chaque côté, permettant à un courant électrique de traverser le mélange. La cuvette est placée dans la chambre de l'électroporateur, qui est équipé de contacts électriques appropriés pour compléter le circuit. Le contrôleur de l'électroporateur permet à l'utilisateur de définir la tension, la forme d'onde et la durée de l'impulsion électrique délivrée. Ces paramètres sont optimisés en fonction du type de cellule spécifique pour obtenir une administration efficace tout en maintenant la viabilité cellulaire.
Figure 1 : Diagramme schématique des principaux composants d’un électroporateur avec une cuvette. Crédit image : Richard Wheeler
Une impulsion électrique perturbe la bicouche phospholipidique de la membrane cellulaire, formant des pores (Figure 2). Ce processus est asymétrique, les pores se formant initialement du côté anodique de la cellule. Simultanément, le potentiel transmembranaire augmente. Cela force les molécules chargées (telles que l'ADN plasmidique) à adhérer initialement à la membrane du côté cathodique de la cellule, puis à traverser ces pores dans la cellule (Figure 3).
Figure 2 : Diagramme schématique de la perturbation de la membrane cellulaire et de la formation de pores pendant l’électroporation. Source de l'image : Réseaux technologiques.
Figure 3 : Diagramme schématique montrant les étapes et les charges associées lors de l’électroporation pour introduire un corps étranger (dans ce cas, un plasmide) dans les cellules. Source de l'image : Réseaux technologiques.
Avantages et limites du service
Relativement simple
La méthode d’électroporation est simple à réaliser
Efficace
Efficace sur les types de cellules difficiles
Aucune exigence de vecteur
ou même aucun vecteur requis
Faible dépendance
Faible dépendance au type de cellule
Transfection accélérée
un grand nombre de cellules à un coût relativement faible
Espèces transfectées
Peut transfecter des espèces avec des parois cellulaires
Équipement spécialisé
Les paramètres doivent être soigneusement optimisés
Dommages cellulaires importants
avec certaines cellules mourant avant la guérison
Paramètres clés
Lors du développement d’un protocole d’électroporation, il est crucial de sélectionner les paramètres appropriés permettant la perméabilisation tout en minimisant la perturbation de la membrane cellulaire, maximisant ainsi la viabilité cellulaire, la reproductibilité expérimentale et l’efficacité. Les facteurs à considérer comprennent :
1. Forme d'onde : impulsion à décroissance exponentielle par rapport à une impulsion à onde carrée
Une impulsion à onde carrée monte rapidement jusqu'à une tension définie, maintient cette tension, puis s'arrête rapidement à la fin de l'impulsion ; une impulsion à décroissance exponentielle monte rapidement jusqu'à la tension cible puis diminue avec le temps. Généralement, les impulsions d’onde carrée sont préférées pour la transfection des mammifères.
2. Durée d'impulsion : pour les impulsions carrées, la durée est généralement définie directement ; pour les impulsions à décroissance exponentielle, la tension diminue progressivement avec le temps, généralement exprimée sous forme de constante de temps (TC). Cela doit être optimisé en fonction de l’ampleur des dommages causés aux cellules.
3. Intensité du champ : Il s'agit de la tension appliquée aux bornes de l'espacement des électrodes. Cette tension dépend de nombreux facteurs, tels que l'espacement des cuvettes, la taille des cellules et la température.
4. Tampon : la résistance du tampon, la concentration en sel et la capacité tampon peuvent toutes affecter l'efficacité de l'électrotransfert. Par exemple, certaines cellules sensibles préfèrent une composition de milieu de culture différente.
5. Température : Une puissance élevée favorise généralement des températures plus basses, comme le fonctionnement sur glace.
6. Modifications du pH : L'électrolyse au niveau de l'électrode peut provoquer des modifications du pH, qui peuvent être ajustées à l'aide du tampon.
7. Nombre de cellules : le surpeuplement peut provoquer des arcs électriques, tandis que des concentrations trop denses peuvent réduire le taux de positivité.
8. Qualité des cellules : étant donné que l'électrotransfert est intrinsèquement dommageable pour les cellules, la qualité des cellules électroporées est cruciale. En règle générale, des cellules saines, non contaminées, en division active et à faible passage doivent être sélectionnées.
9. Qualité du plasmide : Un ADN plasmidique de mauvaise qualité ou contaminé peut réduire l'efficacité de l'électrotransfert.
Autres facteurs : l'humidité, les concentrations élevées de sel et les bulles à la surface de la cuvette peuvent toutes provoquer des arcs électriques.
Expression transitoire et intégration stable
Les méthodes courantes de transfection plasmidique ne disposent pas d'un mécanisme d'intégration spécifique au site. Par conséquent, lorsqu'un plasmide est introduit dans le noyau cellulaire, l'intégration se produit de manière aléatoire et seule une petite partie du plasmide est réparée par des cassures de l'ADN lors de la réplication cellulaire et intégrée dans le génome chromosomique de l'hôte.
Ainsi, nous résumons plusieurs caractéristiques clés :
1
L'intégration aléatoire conduit à une faible efficacité d'intégration et l'intégration dans des régions transcriptionnelles actives n'est pas toujours possible ;
2
Une quantité importante de plasmide non intégré (par exemple, en utilisant une transfection 1x10e6 de 5 μg, pour un vecteur pcDNA3.1 plus un gène cible de 3000 pb, environ 5,37*10e11) Le nombre de copies est progressivement dilué ou dégradé à mesure que les cellules se divisent.
3
Un pic d’expression transitoire se produit généralement dans les 24 à 96 heures.
4
Les copies intégrées doivent subir un dépistage antibiotique pour obtenir des cellules positives, et le maintien de la résistance est nécessaire plus tard.
5
Étant donné que l’intégration se produit par réparation et recombinaison des cassures de l’ADN, il existe une possibilité de cassures supplémentaires sur ce site plus tard, perturbant potentiellement le gène cible. La stabilité constitue donc un défi. Il est recommandé de développer une lignée cellulaire monoclonale stable et d’effectuer une analyse de stabilité par passage.
6
L'ADN linéaire s'intègre plus efficacement que l'ADN circulaire, mais il est plus difficile à mettre en œuvre que l'ADN circulaire.
7
Différents types de cellules présentent des différences significatives, se manifestant à la fois dans la livraison et l'intégration.
8
Le plasmide délivré doit être exempt d’endotoxines, car celles-ci peuvent provoquer une réponse immunitaire.
9
10
Scénarios d'application
Transfection transitoire
recherche d'une expression protéique transitoire à haute copie/supercopie
Construction de lignées cellulaires stables
avec un faible niveau de biosécurité et des exigences moins strictes en matière d'efficacité d'intégration et de localisation
Production de protéines recombinantes
Production d'anticorps thérapeutiques et d'enzymes, d'hormones et de cytokines...
Services de construction de lignées cellulaires stables
CB-Gene fournit des services de développement de lignées cellulaires stables basés sur le « système d'intégration d'électroporation plasmidique ». À ce jour, nous avons généré avec succès plus de 300 modèles de lignées cellulaires stables, démontrant une vaste expérience dans l'intégration du génome basée sur l'électroporation. Veuillez nous contacter pour discuter des exigences de votre projet.
PROJET
Transfection plasmidique-électroporation
Applicabilité cellulaire
Presque toutes les lignées cellulaires
Efficacité
moyenne
Intégration aléatoire
Y
Niveau de biosécurité
BL1
Capacité de transduction génique
-
Taux positif après sélection
élevé
Chronologie
Synthèse génétique et construction plasmidique
4-5 semaines
Paquet de virus
-
Sélection de cellules stables en pool
1-2 semaines
Cellule monoclonale
> 3 semaines
au total
> 8-10 semaines
Charge de travail
moyenne
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