Líneas celulares estables integradas por electroporación de plásmidos
Definición
La electroporación, también conocida como electropermeabilización, es un método de administración no viral altamente eficiente para introducir ácidos nucleicos (ADN o ARN), proteínas, fármacos y otras moléculas en las células. Los pulsos eléctricos cortos y controlados permeabilizan transitoriamente la membrana celular, lo que permite la absorción de estas moléculas.
Después de la electroporación, el ADN plasmídico puede permanecer episomal (no integrado) o, según el diseño experimental, integrarse en el genoma del huésped, lo que da como resultado una expresión transitoria o estable.
Principio de funcionamiento
Durante la electroporación in vitro, una suspensión de células diana y el ADN plasmídico que se introducirá en las células se mezclan en una solución conductora y se colocan en una cubeta (Figura 1). La cámara de muestra de la cubeta de electroporación tiene dos placas de metal a cada lado, lo que permite que pase una corriente eléctrica a través de la mezcla. La cubeta se coloca en la cámara del electroporador, que está equipada con los contactos eléctricos adecuados para completar el circuito. El controlador del electroporador permite al usuario configurar el voltaje, la forma de onda y la duración del pulso eléctrico administrado. Estos parámetros se optimizan según el tipo de célula específico para lograr una entrega eficiente y al mismo tiempo mantener la viabilidad celular.
Figura 1: Diagrama esquemático de los componentes principales de un electroporador con cubeta. Crédito de la imagen: Richard Wheeler.
Un pulso eléctrico altera la bicapa de fosfolípidos de la membrana celular y forma poros (Figura 2). Este proceso es asimétrico y los poros se forman inicialmente en el lado anódico de la celda. Al mismo tiempo, aumenta el potencial transmembrana. Esto obliga a las moléculas cargadas (como el ADN plasmídico) a adherirse inicialmente a la membrana en el lado catódico de la célula y luego pasar a través de estos poros hacia la célula (Figura 3).
Figura 2: Diagrama esquemático de la alteración de la membrana celular y la formación de poros durante la electroporación. Fuente de la imagen: Redes Tecnológicas.
Figura 3: Diagrama esquemático que muestra los pasos y las cargas asociadas durante la electroporación para introducir material extraño (en este caso, un plásmido) en las células. Fuente de la imagen: Redes Tecnológicas.
Ventajas y limitaciones del servicio.
relativamente simple
El método de electroporación es sencillo de realizar.
Eficaz
Efectivo en tipos de células desafiantes
Sin requisitos de vectores
o incluso no se requiere vector
Baja dependencia
Baja dependencia del tipo de célula.
Transfección acelerada
Gran número de células a un coste relativamente bajo.
Transfectar especies
Puede transfectar especies con paredes celulares.
Equipo especializado
Los parámetros deben optimizarse cuidadosamente.
Daño celular significativo
con algunas células muriendo antes de la recuperación
Parámetros clave
Al desarrollar un protocolo de electroporación, es crucial seleccionar parámetros apropiados que logren la permeabilización y al mismo tiempo minimicen la alteración de la membrana celular, maximizando así la viabilidad celular, la reproducibilidad experimental y la eficiencia. Los factores a considerar incluyen:
1. Forma de onda: pulso que decae exponencialmente versus pulso de onda cuadrada
Un pulso de onda cuadrada se eleva rápidamente a un voltaje establecido, mantiene ese voltaje y luego se corta rápidamente al final del pulso; un pulso que decae exponencialmente aumenta rápidamente hasta el voltaje objetivo y luego disminuye con el tiempo. Generalmente, se prefieren los pulsos de onda cuadrada para la transfección en mamíferos.
2. Duración del pulso: para los pulsos de onda cuadrada, la duración normalmente se establece directamente; para pulsos que decaen exponencialmente, el voltaje disminuye gradualmente con el tiempo, generalmente expresado como una constante de tiempo (TC). Esto debe optimizarse en función de la cantidad de daño a las células.
3. Intensidad del campo: se refiere al voltaje aplicado a través del espacio del electrodo. Este voltaje depende de muchos factores, como el espacio de la cubeta, el tamaño de la celda y la temperatura.
4. Tampón: La resistencia del tampón, la concentración de sal y la capacidad de amortiguación pueden afectar la eficiencia de la electrotransferencia. Por ejemplo, algunas células sensibles prefieren una composición de medio de cultivo diferente.
5. Temperatura: La alta potencia generalmente favorece temperaturas más bajas, como operar sobre hielo.
6. Cambios de pH: La electrólisis en el electrodo puede provocar cambios de pH, que se pueden ajustar utilizando el tampón.
7. Número de celdas: el hacinamiento puede provocar la formación de arcos, mientras que las concentraciones demasiado densas pueden reducir la tasa positiva.
8. Calidad de las células: debido a que la electrotransferencia es inherentemente dañina para las células, la calidad de las células que se electroporan es crucial. En general, se deben seleccionar células sanas, no contaminadas, en división activa y de bajo paso.
9. Calidad del plásmido: el ADN plasmídico de mala calidad o contaminado puede reducir la eficiencia de la electrotransferencia.
Otros factores: la humedad, las altas concentraciones de sal y las burbujas en la superficie de la cubeta pueden provocar la formación de arcos.
Expresión transitoria e integración estable
Los métodos comunes de transfección de plásmidos carecen de un mecanismo de integración específico y específico del sitio. Por lo tanto, cuando se introduce un plásmido en el núcleo celular, la integración se produce de forma aleatoria y sólo una pequeña porción del plásmido se repara mediante roturas del ADN durante la replicación celular y se integra en el genoma cromosómico del huésped.
Así, resumimos varias características clave:
1
La integración aleatoria conduce a una baja eficiencia de integración y la integración en regiones transcripcionales activas no siempre es posible;
2
Una cantidad significativa de plásmido no integrado (por ejemplo, usando la transfección 1x10e6 de 5 μg, para un vector pcDNA3.1 más un gen diana de 3000 pb, aproximadamente 5,37*10e11). El número de copias se diluye o degrada gradualmente a medida que las células se dividen.
3
Un pico de expresión transitoria suele ocurrir entre 24 y 96 horas.
4
Las copias integradas deben someterse a pruebas de antibióticos para obtener células positivas y posteriormente se requiere mantenimiento de la resistencia.
5
Debido a que la integración se produce mediante la reparación y recombinación de roturas del ADN, existe la posibilidad de que se produzcan más roturas en este sitio más adelante, lo que podría alterar el gen objetivo. Por tanto, la estabilidad es un desafío. Se recomienda desarrollar una línea celular monoclonal estable y realizar análisis de estabilidad mediante pase.
6
El ADN lineal se integra más eficientemente que el ADN circular, pero es más difícil de distribuir que el ADN circular.
7
Los diferentes tipos de células exhiben diferencias significativas, que se manifiestan tanto en la entrega como en la integración.
8
El plásmido entregado debe estar libre de endotoxinas, ya que las endotoxinas pueden provocar una respuesta inmunitaria.
9
10
Escenarios de aplicación
Transfección transitoria
buscando expresión transitoria de proteínas de alta copia/supercopia
Construcción de línea celular estable
con un bajo nivel de bioseguridad y requisitos menos estrictos de eficiencia de integración y ubicación
Producción de proteínas recombinantes
Producción de anticuerpos terapéuticos y enzimas, hormonas y citocinas...
Servicios de construcción de líneas celulares estables
CB-Gene proporciona servicios de desarrollo de líneas celulares estables basados en el 'Sistema de integración de electroporación de plásmidos'. Hasta la fecha, hemos generado con éxito más de 300 modelos de líneas celulares estables, lo que demuestra una amplia experiencia en la integración del genoma basada en electroporación. Por favor contáctenos para discutir los requisitos de su proyecto.
PROYECTO
Transfección de plásmidos-Electroporación
Aplicabilidad celular
Casi todas las líneas celulares
Eficiencia
media
Integración aleatoria
Y
Nivel de bioseguridad
BL1
Capacidad de transducción de genes
-
Tasa positiva después de la selección
alta
Línea de tiempo
Síntesis de genes y construcción de plásmidos
4-5 semanas
Paquete de virus
-
Selección de células estables en grupo
1-2 semanas
Célula monoclonal
>3 semanas
en total
> 8-10 semanas
Carga de trabajo
media
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