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Personalización del producto estándar

Principio de servicio

El nombre completo de DdPCR es Droplet Digital PCR, que bio-rad describe como La tecnología Droplet Digital PCR es un método de PCR digital que utiliza un sistema de gotas de emulsión de agua y aceite. Las gotitas se forman en una emulsión de agua y aceite para formar las particiones que separan las moléculas de ADN molde. Las gotitas cumplen esencialmente la misma función que los tubos de ensayo o pocillos individuales en una placa en la que se lleva a cabo la reacción de PCR, aunque en un formato mucho más pequeño. La partición masiva de muestras es un aspecto clave de la técnica ddPCR.

A partir de los principios básicos, no es difícil ver que la mayor ventaja de la DdPCR es la cuantificación absoluta, que se expresa como:

Cuantificación absoluta

La tecnología ddPCR puede proporcionar recuentos absolutos de copias de ADN objetivo para cada muestra de entrada sin introducir una curva estándar, lo que hace que esta tecnología sea ideal para la medición del ADN objetivo, el análisis de carga viral y la cuantificación microbiana.

Alta precisión

La gran cantidad de asignaciones de muestras proporcionadas por ddPCR puede medir de manera confiable pequeñas diferencias en el número de copias de la secuencia de ADN objetivo en la muestra.

Relación señal-ruido mejorada

Diluya las plantillas y el fondo con alto contenido de copias, enriquezca eficazmente la concentración de la plantilla en la partición positiva del objetivo, de modo que se puedan detectar objetivos raros con sensibilidad y se pueda lograr una precisión cuantitativa de ±10%, la sensibilidad puede alcanzar una única molécula de ácido nucleico y el límite de detección es tan bajo como 0,001%.

Eliminar el sesgo de PCR

Elimine la dependencia de la eficiencia de la amplificación de qPCR, reduzca la tasa de error y detecte diferencias pequeñas (1,2 veces), aquí cabe señalar.

Costos de consumibles reducidos

Los volúmenes de reacción en el rango de picolitros a nanolitros reducen el uso de reactivos y el volumen de muestra por punto de datos, especialmente para muestras preciosas.

Excelente partición

La tecnología ddPCR puede generar 20.000 gotas por muestra de 20 µl y se pueden realizar casi 2 millones de reacciones de PCR divididas en una placa de 96 pocillos. Cuantas más particiones, mayor será la precisión.

Solicitud de servicio

Combinado con el campo de los tumores, generalmente tenemos 4 aplicaciones relacionadas con él:

Detección de Expresión Genética, principalmente análisis cuantitativo de detección de ARNm.

Detectar mutación (SNV e Indel), puede detectar el número de copias y también puede detectar la proporción.

Detectar Fusion, puede detectar el número de copias y también puede detectar la proporción.

Detección de CNV (análisis de variación del número de copias), cuantificación relativa.

Presentación del caso

CB-Gene desarrolla kits de detección correspondientes para las aplicaciones anteriores y utiliza los productos de referencia de CB-Gene para evaluar el rendimiento de los kits. Tomemos como ejemplo el EGFR T790M:

Experimento 1: prueba de límite en blanco LOB

Muestras a analizar: 20 muestras negativas y 1 NTC. La cantidad de entrada se estableció en 10 ng y 40 ng respectivamente, y cada muestra se analizó mediante PCR digital Bio-Rad por duplicado.

Muestra 10ng	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	CNT
norte=1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1.2	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
norte=2	0	0	0	0	0	0	0	0.6	0	0	0	0	0	0.8	0	0	0	0	0	0	0

Muestra 40ng	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	CNT
norte=1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1.3	0	0	0	0	0	0	0	0.9	0	0	0
norte=2	0	0	0	0.7	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

De los datos anteriores, se puede ver que ya sea 10 ng o 40 ng, el LOB se controla dentro de 2 copias (generalmente las copias de ruido están dentro de 5) y el ruido no depende de la dosis y es una señal de ruido generada aleatoriamente.

Experimento 2: prueba de precisión

Muestras a analizar: 10 muestras verificadas como positivas por NGS (numeradas del 1 al 10); 10 muestras verificadas como negativas por NGS (numeradas del 11 al 20). Se utilizó PCR digital para analizar las 20 muestras.

Muestra	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Valor	72,21%	66,63%	13,25%	5,29%	10,34%	43,01%	22,19%	3,27%	1,07%	13,29%
Resultados	Positivo	Positivo	Positivo	Positivo	Positivo	Positivo	Positivo	Positivo	Positivo	Positivo

Muestra	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
Valor	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%
Resultados	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo

De los datos anteriores, podemos ver que:
① Pruebe 10 muestras positivas de NGS, todos los resultados de la prueba son positivos, la tasa de cumplimiento positivo es del 100% y la frecuencia de variación se detecta cuantitativamente.
② Pruebe 10 muestras negativas de NGS, todos los resultados de la prueba son negativos, la tasa de cumplimiento negativo es del 100% y la frecuencia de variación fija es del 0%.

Experimento 3: prueba de rango lineal

1. Prueba lineal entre la cantidad de entrada y el número y frecuencia de copias
Primero, seleccione el estándar EGFR T790M (CBP10402) con una frecuencia de mutación del 50%. Este estándar es un gen de dos alelos con CN=2 editado mediante edición de genes. Una es mutación y la otra es WT. Después del cálculo del valor teórico, la secuenciación de Sanger y el kit Bio-Rad DdPCR (ID de ensayo: dHsaCP2000019), se confirma que tiene una frecuencia del 50 %.
1.1 Establezca 10 gradientes entre 0,1 ng y 200 ng de cantidad de entrada y realice una detección por PCR digital (2 réplicas) para considerar si el número de copias de FAM está relacionado linealmente con la cantidad de entrada y si el número de copias de VIC está relacionado linealmente con la cantidad de entrada;
1.2 Establezca 10 gradientes entre 0,1 ng y 200 ng de cantidad de entrada y realice una detección por PCR digital (2 réplicas) para determinar si se satisface la fluctuación de %AF=50±10%.

Entrada	200	100	50	20	10	5	2	1	0.5	0.1
Copias FAM(n=1)	18970	14970	7238	3327	1570	786	288	139	87	23
Copias FAM(n=2)	18367	15013	7139	3122	1430	722	290	151	67	21
Copias del VIC (n=1)	20183	15180	7312	3290	1540	739	267	150	93	31
Copias del VIC (n=2)	19783	14962	7016	3017	1510	697	281	143	80	30

Entrada	200	100	50	20	10	5	2	1	0.5	0.1
%FA(n=1)	48.45	49.65	49.75	50.28	50.48	51.54	51.89	48.10	48.33	42.59
%FA(n=2)	48.14	50.09	50.43	50.86	48.64	50.88	50.79	51.36	45.58	41.18

De los datos anteriores, podemos ver que:
① La entrada de 200 ng es demasiado grande, el número de copias no es lineal, aunque cumple con el rango de 45-55%, no es adecuado para la determinación del número de copias de un solo canal;
②La entrada de 0,1 ng es demasiado pequeña, el número de copias no es lineal y el 42,59% también es inferior al 45%, lo que no es adecuado para un solo canal o dos canales;
Por lo tanto: el rango es 0,5-100 ng

2. Prueba lineal de valores teóricos y valores de detección a diferentes frecuencias de dilución lineal.
Con base en las conclusiones anteriores, seleccionamos 10 ng como una exploración adicional del rango lineal de %AF. Primero, utilizamos el estándar negativo correspondiente de EGFR T790M, realizamos una dilución limitante al 50% del estándar, establecimos 9 gradientes de AF entre 0,1% y 50% y realizamos una detección por PCR digital (2 réplicas).

%AF esperado	50±10%	25±10%	10±10%	5±20%	3±20%	1±30%	0,5±30%	0,2±30%	0,1±50%
%AF(n=1)	49.14	24.82	9.82	4.52	2.94	0.95	0.55	0.16	0.13
%AF(n=2)	50.25	26.20	10.24	4.98	2.55	0.79	0.59	0.19	0.13

A partir de los datos anteriores, podemos ver que con una entrada de 10 ng, el %AF muestra una dilución lineal muy buena, con algunas fluctuaciones, pero todas dentro del rango de error.

Experimento 4: prueba de límite de detección

Podemos predecir el posible rango del límite de detección mediante cálculos teóricos. Cuando la copia de control está dentro de 15000 (correspondiente a una entrada de 50 ng), los datos LOB son 2, 2/15000 = 0,0133% y el límite de detección previsto es 0,0200%.
Con una frecuencia tan baja, el escenario de aplicación clínica es adecuado para el ctDNA. En términos generales, en la práctica clínica, la mediana del ctDNA de 10 ml de sangre total es de 20 a 40 ng y el valor más bajo es de 20 ng. El valor teórico de 20 ng es 6000 copias, 2/6000 = 0,0333% y el límite de detección previsto es 0,0500%.
El rango de error de 0,05% es ±50%, que es 0,025-0,075%, por lo que elegimos 3 puntos y exploramos LOD de 0,010%, 0,050% y 0,100%, respectivamente, lo que requiere una detección del 95%.

0,010 %
Realice una prueba de PCR digital en 20 muestras con 0,01 % para ver si se logra una detección del 95 % entre 0,005 y 0,015 %.

0,05%
Se realizó una prueba de PCR digital en 20 muestras de 0,05% para observar si se logró una detección del 95% entre 0,025-0,075%.

0,1 %
Se realizó una prueba de PCR digital en 20 muestras de 0,1 % para observar si se logró una detección del 95 % entre 0,05 y 0,15 %.

Frecuencia de predicción LOD	0,01%	0,05%	0,10%
Tasa de logro	65%	95%	100%

A partir de los datos anteriores, se puede ver que se selecciona 0,05 % como límite de detección LOD del kit de detección.

Experimento 5: prueba de precisión

Seleccione 20 muestras con una tasa positiva fuerte del 2 %, 20 muestras con una tasa positiva media del 1 % y 20 muestras con una tasa positiva débil del 0,2 % para la detección por PCR digital.

	Alto Positivo2%	Medio Positivo 1%	Positivo bajo 0,2%
AVG	1,9959%	1,0027%	0,1878%
DAKOTA DEL SUR	0.001039	0.001135	0.000295
CV%	5.2058	11.3177	15.7011
Incertidumbre de medición	1,16%	2,53%	3,51%

De los datos anteriores, se puede ver que bajo los tres sistemas de detección de positivo fuerte del 2%, positivo medio del 1% y positivo débil del 0,2%, los errores están todos dentro de un rango razonable y la precisión es buena.

Experimento 6: prueba de recuperación

Primero, se usó el estándar negativo correspondiente de EGFR T790M para realizar una dilución limitante al 50% del estándar, y cada gradiente se diluyó dos veces con la muestra negativa, y luego se analizaron 11 muestras.

Muestra	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
%FA	50.00	25.00	12.50	6.25	3.125	1.563	0.781	0.391	0.195	0.098	0.049
%Tasa de recuperación	99.0	100.1	99.4	108.8	95.6	91.1	112.2	92.4	84.8	81.3	82.1

De los datos anteriores se puede ver que cuando la FA está en el rango de 0,05% -50%, la tasa de recuperación correspondiente está en el rango de 80-120%, lo que está en línea con las expectativas.

Experimento 7: prueba de repetibilidad

Tome 10 muestras estándar con diferente AF (1%~50%) y organice al Operador A y al Operador B para realizar cuatro pruebas el mismo día.

De los datos anteriores se puede ver que el sistema de detección EGFR T790M es estable y reproducible.

Experimento 8: prueba de reproducibilidad

Tome 10 muestras estándar con diferente AF (1%~50%) y organice ① el Operador A y el Operador B para realizar cuatro pruebas experimentales cada uno el mismo día; ② El operador A realiza cuatro pruebas experimentales el primer día y el segundo día respectivamente; ③ El operador A realiza cuatro pruebas experimentales el primer día y el operador B realiza cuatro pruebas experimentales el segundo día.

De los datos anteriores, se puede ver que el sistema de detección EGFR T790M es estable y reproducible en diferentes personas y en diferentes momentos.

CB-Gene ha desarrollado una variedad de sistemas de detección de kits de dPCR y utilizó sus propios estándares para verificar el rendimiento. Se puede utilizar para la detección de mutaciones genéticas, fusiones, variaciones en el número de copias, etc. Al mismo tiempo, podemos brindar servicios de investigación científica para la detección de dPCR, basados en sus fuertes ventajas de valor absoluto y cuantificación precisa, para brindar servicios de alta calidad para las pruebas de muestras de los clientes.

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