Pregunta 1 de CB-Gene : En general, se cree que durante este paso de construcción, la FRT se integrará en la región transcripcionalmente activa de la célula. Esto significa que para la expresión posterior del gen diana exógeno recombinante, este paso de integración proporciona un cierto grado de seguridad para la sobreexpresión de la proteína exógena.
Para ubicaciones de integración específicas, consulte nuestro servicio ISS (Integration Site Search).
Pregunta 2 de CB-Gene : En un protocolo de transfección de plásmido convencional, ¿cuántas copias se pueden integrar en la célula huésped? ¿Cuál es el número óptimo de copias? En términos generales, cuando se construyen células madre Flp-FRT, la integración se produce de forma aleatoria después de la transfección, lo que significa que se integrarán múltiples copias en diferentes ubicaciones cromosómicas de la célula huésped. Cuantas más copias se integren, más probable será que el gen diana se recombine e integre, lo que indica una mayor expresión. Sin embargo, cuando se recombina el gen diana, la eficiencia de integración de múltiples copias puede no ser del 100%, lo que da como resultado clones mixtos (niveles de expresión inconsistentes entre clones). A veces, para las proteínas diana que no requieren una alta expresión, Kebai recomienda seleccionar clones con una única copia integrada. De esta manera, cualquier clon que pase la prueba de resistencia es, en principio, un clon único, lo que elimina la necesidad de limitar la clonación por dilución.
Para la detección del número de copias, consulte nuestro servicio de detección de dPCR.
CB-GeneCélulas Flp-FRT de punto interno de
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2. Integración del gen diana:
Un vector de expresión que contiene el gen objetivo y un vector de expresión que contiene recombinasa Flp se cotransfectan en las células del paso 1. La recombinasa Flp media la recombinación específica del sitio entre los sitios FRT en el genoma del huésped y aquellos en el vector de expresión, logrando la integración del gen objetivo y permitiendo una expresión estable bajo el control del promotor.
Transportista 1:
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Sobreexpresión de recombinasa Flp, no se requiere resistencia, no se requiere integración estable
Transportador 2:
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Contiene gen diana y segundo marcador de selección de gen de resistencia.
Proceso de reorganización :
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Formación final :
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Después de la recombinación, se pueden seleccionar células positivas a través del segundo gen de resistencia, y las células son tolerantes al gen de resistencia 2 y sensibles al gen de resistencia 1.
