Líneas celulares estables integradas en lentivirus

Para mejorar la bioseguridad en la producción de lentivirus en el laboratorio, se eliminan los componentes virales no esenciales y los elementos esenciales se distribuyen en múltiples plásmidos.
Esta estrategia de diseño ha dado como resultado cuatro generaciones de sistemas de envasado lentivirales ampliamente utilizados:

Los plásmidos de primera generación incluyen (Figura 2) :
1. Plásmido de transferencia: contiene el transgén y la LTR de tipo salvaje.
2. Plásmido de empaquetamiento: contiene el genoma viral completo (genes de empaquetamiento, reguladores y accesorios), menos solo la envoltura.
3. Plásmido de envoltura: contiene el env.

 

Los plásmidos de cuarta generación incluyen (Figura 5):

Figura 5 Sistema de plásmidos lentivirales de cuarta generación.

 

Los sistemas de envasado lentivirales de cuarta generación están optimizados para ofrecer rendimiento viral, facilidad de uso y bioseguridad mejorada. Estos sistemas incorporan promotores inducibles por tetraciclina para permitir la activación transcripcional controlada, al tiempo que retienen Tat para lograr un alto nivel de expresión de componentes virales esenciales. Para reducir aún más el riesgo de recombinación, elementos virales clave como gag-pro y vpr-pol se separan en múltiples plásmidos, lo que aumenta la separación genética y minimiza la probabilidad de formación de lentivirus con capacidad de replicación (RCL). Este diseño permite una producción eficiente de lentivirus manteniendo un alto nivel de bioseguridad. Se ha informado que los sobrenadantes virales no concentrados producidos utilizando sistemas de cuarta generación alcanzan títulos de hasta 5 × 10⁸ IFU/ml.

En resumen, a través de sucesivas mejoras en el diseño, los sistemas de envasado lentivirales de cuarta generación se han adoptado ampliamente en entornos de laboratorio, ofreciendo un equilibrio óptimo entre seguridad, usabilidad y alto rendimiento viral.

 

1. El empaquetado de lentivirus requiere la selección de una línea celular productora. HEK293T se utiliza comúnmente. En comparación con HEK293, las células HEK293T expresan el antígeno T grande de SV40, lo que permite que los plásmidos que contienen el origen de replicación de SV40 se repliquen episomalmente, lo que da como resultado un mayor número de copias. Las células HEK293T también tienen una mayor eficiencia de transfección y admiten títulos virales más altos.

2. 293T/17 es un subclon de células 293T que también expresa el antígeno T grande SV40. Se seleccionó el clon 17 por su mayor eficiencia de transfección en las pruebas.

3. 293FT también es un derivado de las células 293T, una variante de rápido crecimiento que también expresa el antígeno T grande SV40.

4. Las células Lenti-X 293 también son un derivado de las células 293T que expresan el antígeno T grande SV40. Se ha informado que las células Lenti-X 293 pueden empaquetar seis veces más lentivirus que las células 293FT. 

 

5. Células 293T en suspensión y diversos derivados de células en suspensión. Las células en suspensión pueden alcanzar densidades más altas y pueden expandirse a biorreactores. No contienen suero, lo que facilita la purificación y concentración posteriores.

6. Las líneas celulares de producción estables, con los componentes de empaque necesarios integrados de manera estable en el huésped, simplifican el proceso de producción y garantizan la estabilidad del lote del virus, eliminando la necesidad de empaques individuales necesarios para la transfección transitoria.

Figura 6 Diagrama de empaquetado de lentivirus

Las preparaciones lentivirales de alto título y alta pureza son esenciales para una transducción eficiente de las células diana. Por lo tanto, los sobrenadantes virales recolectados generalmente requieren una purificación y concentración adicionales antes de las aplicaciones posteriores.

 

Hay una variedad de métodos disponibles para la concentración y purificación de lentivirales. La elección del enfoque depende de factores como el volumen de la muestra, la pureza requerida, el tiempo de procesamiento y la escalabilidad. Los métodos comúnmente utilizados incluyen técnicas basadas en centrifugación, filtración, precipitación y captura basada en afinidad. Algunos métodos, como la ultracentrifugación, proporcionan una alta pureza pero pueden llevar mucho tiempo, mientras que otros, como la precipitación con polietilenglicol, son más rápidos pero es posible que no alcancen la misma pureza. Las técnicas más nuevas, como las que utilizan nanopartículas magnéticas, permiten una concentración rápida y de alto rendimiento con una manipulación mínima.

La siguiente es una descripción detallada de algunos métodos clave:
1. Centrifugación:
Centrifugación diferencial:
este método utiliza diferentes velocidades de centrifugación para separar los virus de los desechos celulares y otros componentes según el tamaño y la densidad.
Ultracentrifugación:
esta técnica utiliza velocidades extremadamente altas para sedimentar el virus, concentrándolo y purificándolo así.
Ultrafiltración centrífuga:
este método utiliza membranas con límites de peso molecular específicos para filtrar partículas más grandes y concentrar el virus. 

 

2. Filtración:
Filtración de flujo tangencial: este método utiliza una membrana para separar las partículas virales de un líquido a granel, lo que permite un flujo y una concentración continuos.
Adsorción/elución por membrana: los virus se pueden adsorber en filtros de membrana específicos y luego eluir utilizando un tampón adecuado.
 

3. Precipitación:
Precipitación con polietilenglicol (PEG): El PEG se utiliza para precipitar virus de la solución para su recolección y concentración.
Coprecipitación: en algunos casos, los virus pueden coprecipitarse con otras sustancias (p. ej., proteínas) para mejorar la concentración.
 

4. Inmunocaptura:
captura basada en anticuerpos: los virus se pueden capturar utilizando anticuerpos que se unen específicamente al virus, lo que permite su aislamiento y concentración.

5. Otros métodos:
Nanopartículas magnéticas: Estas nanopartículas se pueden utilizar para capturar y concentrar virus, proporcionando una concentración rápida y eficiente.
Separación acústica: este método utiliza ondas sonoras para separar partículas según su tamaño y densidad, lo que ofrece potencialmente un método suave y eficaz para la concentración viral.
Condensación a base de agua: esta nueva tecnología está en desarrollo para tomar muestras de virus en el aire.

 

El título viral se refiere a la concentración de partículas virales infecciosas en una preparación y es un parámetro crítico para la transducción lentiviral. Después de la concentración, los títulos virales generalmente se determinan antes de infectar las células objetivo para garantizar resultados consistentes y reproducibles. Hay varios métodos disponibles para medir los títulos virales, incluidos ensayos de placas, ensayos de formación de focos y otras técnicas de cuantificación basadas en partículas o infectividad.

1. Ensayo en placa:
este método implica infectar una monocapa de células huésped con diluciones en serie de una muestra viral.
Después de la incubación, se forman placas visibles (áreas de lisis o muerte celular) y se cuenta el número de placas.
El título se calcula en función del número de placas, el factor de dilución y la cantidad de virus utilizado.

2. Ensayo de enfoque:
similar al ensayo de placa, este método cuantifica la cantidad de focos (áreas de células infectadas) formados después de la infección.
El título se determina contando los focos y teniendo en cuenta la dilución y el volumen.

3. Otros métodos:
qPCR: Cuantifica el ARN o ADN viral, proporcionando una medida del total de partículas virales.
ELISA: Detecta antígenos virales, proporcionando un método para cuantificar la carga viral.
Citometría de flujo: se puede utilizar para contar células infectadas individuales, especialmente aquellas que expresan marcadores fluorescentes.

Figura 7. Productos presentes en el sobrenadante del envase lentiviral

 

Los métodos físicos pueden medir partículas funcionales y no funcionales liberadas en el sobrenadante, así como proteínas libres de la cápside (p. ej., p24). Los métodos de titulación funcional miden específicamente partículas virales funcionales.

 

Puntos importantes a tener en cuenta :
1. Título infeccioso frente a título físico:
algunos métodos miden el número de partículas virales infecciosas (título infeccioso), mientras que otros miden el número total de partículas virales (título físico). El título infeccioso refleja mejor la capacidad del virus para infectar y transducir. Sin embargo, la detección del título infeccioso generalmente lleva más tiempo, mientras que la detección del título físico es más rápida. Por lo tanto, un tipo de método establece una relación de conversión entre 'título infeccioso' y 'título físico'.
 

2. ¿Cuál es la diferencia entre unidades formadoras de placa (UFP), unidades de transducción (TU) y unidades infecciosas (IFU)? ¿Cuál refleja mejor la cantidad de virus activo utilizado?
1) UFP (unidad formadora de placa) indica la cantidad de virus vivos o infecciosos. UFP/ml se utiliza para calibrar el título viral midiendo el número de placas formadas después de la infección viral y refleja la cantidad de virus activo en la preparación.
2) IFU (unidad infecciosa) equivale a PFU.
3) TU/ml: unidades de transducción/ml, indica el número de partículas virales biológicamente activas por mililitro de veneno viral, es decir, el número de genomas virales capaces de infectar e ingresar a las células diana. Esta es una unidad de medida comúnmente utilizada para los lentivirus y refleja la cantidad de virus activo en una preparación.
La cantidad de IFU suele ser menor que la cantidad de TU porque no todas las partículas virales que ingresan a las células inician con éxito una infección productiva.

 

La transducción lentiviral implica la integración del gen diana en el genoma del huésped. Esto se logra modificando las enzimas transcriptasa inversa e integrasa codificadas dentro del vector lentiviral, lo que permite la expresión sostenida del gen exógeno. A diferencia de otros vectores virales, los lentivirus pueden transducir células que no se dividen, lo que ofrece ventajas únicas en aplicaciones de administración de genes.

Al establecer líneas celulares estables, los lentivirus infectan las células huésped. El ADN transcrito de forma inversa permanece parcialmente libre en las células, mientras que la enzima integrasa integra las secuencias LTR 5' a 3' del vector lentiviral en el genoma del huésped. Mediante la detección selectiva de resistencia, las células no integradas mueren y las células supervivientes pueden expandirse para establecer líneas celulares estables. Los estudios han demostrado que se necesitan aproximadamente de 10 a 14 días para que el ADN no integrado se degrade por completo a medida que las células se dividen, que es también el período de detección de resistencia mediante presión.

Los lentivirus (LV) son virus envueltos, el más común de los cuales es VSV-G. Entran en las células uniéndose a proteínas específicas de la superficie celular (como el LDLR), luego se fusionan con la membrana e inyectan ARN viral que contiene su información genética en el citoplasma. Este ARN viral monocatenario se convierte en ADN mediante transcripción inversa. El ADN viral ingresa al núcleo de la célula y se integra en el genoma de la célula huésped mediante la integrasa viral.

Figura 8 Diagrama esquemático de la integración del lentivirus en el genoma del huésped.

 

1. Selección de MOI: una MOI demasiado baja dará como resultado una baja eficiencia de transducción, mientras que una MOI demasiado alta puede causar citotoxicidad. Los experimentos de titulación de MOI son necesarios para determinar las condiciones óptimas de infección.

2. Uso de polibreno: El polibreno es un policatión que reduce la repulsión de carga entre el virus y la membrana celular, mejorando así la eficiencia de transducción. Sin embargo, si la dosis es inadecuada, también puede provocar daño celular.

3. Momento: La transducción debe realizarse tan pronto como se haya recuperado la viabilidad celular, asegurando que las células estén en una fase de proliferación activa lo antes posible.

4. Control de la densidad celular: una densidad celular excesivamente alta aumenta los costos de transducción, mientras que una densidad excesivamente baja puede afectar la eficiencia. Se recomienda mantener una densidad celular de aproximadamente 1-2 × (10^5) células/ml.

5. Concentración y título viral: El título de lentivirus afecta directamente la eficiencia de la transducción, lo que enfatiza la importancia de comprender el título viral y controlar la adición viral.

6. Integración: Los estudios de integración viral de todo el genoma han demostrado que los lentivirus se integran con mayor frecuencia en regiones transcripcionalmente activas, regiones involucradas recientemente en eventos de translocación y otras ubicaciones genómicas 'vulnerables', y esta preferencia se conserva en todas las especies objetivo. Si bien la tendencia general hacia la integración es conocida, sigue siendo aleatoria y difícil de predecir.

 

Finalmente:

Debido a su capacidad para integrarse de manera estable en el genoma del huésped y respaldar la expresión transgénica a largo plazo, los vectores lentivirales se utilizan ampliamente tanto en entornos clínicos como de investigación. Las aplicaciones comunes incluyen la generación de líneas celulares estables, la entrega de bibliotecas CRISPR, el desarrollo de modelos animales y la investigación de terapia génica. La transducción lentiviral proporciona un enfoque de administración de genes confiable y versátil en una amplia gama de tipos de células, incluidas las células que no se dividen y que a menudo son refractarias a otros métodos de transducción. El diseño experimental cuidadoso y la optimización pueden mejorar significativamente la eficiencia de la transducción y la estabilidad de la expresión genética.

 

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PROYECTO		Transducción viral-Lentivirus
Aplicabilidad celular		Casi todas las líneas celulares
Eficiencia		alto
Integración aleatoria		Y
Nivel de bioseguridad		BL2
Capacidad de transducción genética		<4-5k
Tasa positiva después de la selección		alto
línea de tiempo	Síntesis de genes y construcción de plásmidos.	4-5 semanas
	paquete de virus	1-2 semanas
	Selección de células estables del grupo	1-2 semanas
	Célula monoclonal	>3 semanas
	total	>9-11 semanas
Carga de trabajo		medio