qPCR, abreviatura de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real, es una técnica de biología molecular que utiliza señales fluorescentes para monitorear la amplificación del ADN y cuantificar la cantidad inicial de ácidos nucleicos objetivo (ADN o ADNc) en tiempo real. Su valor fundamental radica en su capacidad para detectar la presencia de un gen diana y determinar con precisión su número de copias inicial. Como resultado, la qPCR se considera ampliamente como el estándar de oro para aplicaciones como el análisis de expresión genética y la detección de patógenos.
Principio de funcionamiento
La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) integra tintes o sondas fluorescentes en el sistema de detección de PCR. Al medir la intensidad de la fluorescencia en cada ciclo de amplificación, qPCR permite el monitoreo en tiempo real de la acumulación de productos de PCR, lo que permite tanto la detección cualitativa como el análisis cuantitativo de la plantilla de ácido nucleico inicial. A medida que avanza la amplificación, los productos fluorescentes de la PCR se acumulan proporcionalmente, generando una curva de amplificación característica.
Una curva típica de amplificación por PCR en tiempo real consta de tres fases: inicial, exponencial y meseta.
Línea de base: durante esta fase, la señal de fluorescencia permanece en niveles de fondo y no se puede distinguir de manera confiable del ruido.
Exponencial: la señal de fluorescencia se eleva por encima del fondo y aumenta exponencialmente. El número de ciclo en el que la señal de fluorescencia cruza un umbral definido se conoce como valor Ct (umbral de ciclo). El logaritmo de la concentración inicial de la plantilla se correlaciona linealmente con el valor de Ct, lo que constituye la base para el análisis cuantitativo.
Meseta: en esta fase, la eficiencia de amplificación disminuye y la acumulación de producto se estabiliza. En consecuencia, la cantidad final de producto de PCR ya no refleja la concentración de la plantilla inicial y no se puede utilizar para una cuantificación precisa.
Métodos de detección
La cuantificación de qPCR se puede realizar utilizando estrategias de cuantificación absoluta o relativa, comúnmente implementadas con ensayos basados en colorantes SYBR Green I o ensayos basados en sondas TaqMan.
Cuantificación absoluta : la cuantificación absoluta, también conocida como método de curva estándar, determina la cantidad inicial de una plantilla objetivo en una muestra desconocida en comparación con una curva estándar. Una serie de estándares preparados mediante dilución en serie de 5 a 6 puntos (CoBioGene proporciona una amplia gama de estándares validados) se amplifican mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se genera una curva estándar trazando el logaritmo del número de copia inicial de la plantilla de destino en el eje x frente a los valores Ct (umbral de ciclo) correspondientes en el eje y. Luego se establece una ecuación de regresión lineal y el valor Ct de la muestra desconocida se aplica a esta ecuación para calcular la cantidad inicial de la plantilla objetivo.
Cuantificación relativa : la cuantificación relativa mide los cambios en la expresión genética comparando la abundancia de un gen diana entre diferentes muestras, entre diferentes regiones dentro de la misma muestra o entre diferentes puntos de tiempo experimentales. Este método normalmente implica la normalización con respecto a un gen de referencia y también se puede utilizar para analizar la proporción del número de copias de un gen objetivo en relación con un control endógeno dentro de la misma muestra.
Proceso de servicio
Ventajas
Alta sensibilidad
En teoría, puede detectar tan solo unas pocas copias de moléculas de ácido nucleico.
Alta especificidad
Especialmente utilizando el método de sonda TaqMan, puede distinguir eficazmente secuencias altamente homólogas y polimorfismos de un solo nucleótido (SNP).
Cuantificación precisa
Proporciona resultados digitales con un amplio rango dinámico (que abarca entre 7 y 8 órdenes de magnitud).
Alto rendimiento
El formato de placa de 96 o 384 pocillos permite realizar pruebas simultáneas de una gran cantidad de muestras, lo que resulta en una eficiencia extremadamente alta.
Solicitud de servicio
La PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real, caracterizada por una alta sensibilidad, fuerte especificidad, rapidez y alta eficiencia, se usa ampliamente en campos como la biomedicina, el diagnóstico clínico, la agricultura y las ciencias ambientales. Se utiliza comúnmente para monitorear la expresión genética, las mutaciones genéticas y los transgénicos.
Investigación Científica Básica:
Análisis de expresión genética/Investigación de microARN y ARN no codificante/Epigenética
Diagnóstico Médico y Medicina de Precisión:
Detección de patógenos y análisis de carga viral/Prueba de marcadores moleculares tumorales/Diagnóstico de enfermedades genéticas/Pruebas prenatales no invasivas (NIPT)
Agricultura y biotecnología:
Pruebas de organismos genéticamente modificados (OGM)/Cría de animales y plantas/Seguridad alimentaria y detección de patógenos
Desarrollo de fármacos y control de calidad biofarmacéutica:
Investigación sobre el mecanismo de acción del fármaco/ensayo de título de vectores virales
CB-Gene tiene la certificación ISO 9001 e implementa todos los procedimientos de prueba qPCR de acuerdo con los requisitos de CNAS para garantizar una calidad y confiabilidad constantes.
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