Sondas cebadoras qPCR

Definición

1.qPCR (Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa): reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa

*comúnmente conocida como PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real.

*Es una técnica que utiliza señales fluorescentes para monitorear y cuantificar plantillas de ADN/ARN en tiempo real durante el proceso de amplificación por PCR. No sólo determina la presencia del gen diana (cualitativo), sino que también calcula con precisión su contenido inicial (cuantitativo).

2.Primer

*Un cebador es un fragmento corto de ADN monocatenario.

*Reconoce específicamente los extremos de la secuencia de ADN objetivo que se va a amplificar y sirve como punto de partida para la replicación del ADN. Piense en ello como un 'gancho' que se engancha específicamente al fragmento objetivo que se va a replicar.

3.Sonda

*Una sonda también es un fragmento corto de ADN monocatenario, normalmente diseñado entre dos cebadores.

*Un extremo de la sonda está vinculado a un informador (como FAM) y el otro a un extintor.

*Cuando los grupos extintor y reportero están muy cerca (es decir, en una sonda intacta), el extintor absorbe la fluorescencia emitida por el grupo reportero y el instrumento no puede detectar la señal fluorescente.

*Durante la PCR, la ADN polimerasa encuentra la sonda durante la replicación del ADN y utiliza su actividad exonucleasa para hidrolizar y escindir la sonda. Esto separa los grupos indicador y extintor, y la fluorescencia emitida por el grupo indicador ya no se extingue, lo que permite que el instrumento la detecte.

En resumen:

Las sondas cebadoras qPCR son un conjunto de pares de cebadores cuidadosamente validados y sondas marcadas con fluorescencia diseñadas para experimentos de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR). Trabajando juntos, garantizan la detección específica, sensible y cuantitativa de niveles extremadamente bajos de secuencias genéticas específicas en una muestra.

El papel de los cebadores y sondas de qPCR

1.Especificidad: Las secuencias de cebadores y sondas se diseñan en base a regiones únicas del gen diana, asegurando que solo se amplifique y detecte la diana deseada (como un gen viral), sin detectar erróneamente otros genes no relacionados, evitando así falsos positivos.

2.Generación de señal: la sonda es clave para la detección cuantitativa de qPCR. Con cada cadena de ADN objetivo amplificada, se hidroliza una sonda, lo que libera una señal fluorescente. Por tanto, la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la cantidad de producto de la PCR.

3.Cuantificación precisa: el instrumento monitorea los cambios en la señal de fluorescencia en tiempo real durante todo el ciclo de PCR. Cuanto mayor sea la cantidad de plantilla inicial en la muestra, menor será el número de ciclos necesarios para que la señal de fluorescencia alcance el umbral establecido (valor Ct). Al compararlo con un estándar de concentración conocida, se puede calcular con precisión el número de copias del gen diana en la muestra original.

Relacionado con enfermedades

La tecnología de sonda de cebador qPCR es relevante para casi todas las enfermedades que involucran infección por patógenos y expresión genética, y tiene aplicaciones extremadamente amplias.

1.Pruebas de enfermedades infecciosas (aplicaciones más conocidas):

*Enfermedades virales: COVID-19 (COVID-19), influenza, VIH/SIDA, hepatitis B (VHB), hepatitis C (VHC), Ébola, dengue, etc. La 'Prueba de ácido nucleico' durante la pandemia implica el uso de cebadores y sondas de qPCR para detectar el ARN del SARS-CoV-2.

*Enfermedades Bacterianas: Tuberculosis, gonorrea, clamidia, sepsis, identificación de patógenos, etc.

*Otros Patógenos: Malaria, infecciones por hongos, etc.

2.Diagnóstico de enfermedades genéticas:

Se utiliza para detectar mutaciones, eliminaciones o duplicaciones genéticas asociadas con enfermedades genéticas. Los ejemplos incluyen la talasemia, la hemofilia, la distrofia muscular de Duchenne y el cáncer de mama hereditario (genes BRCA1/2).

3.Cáncer:

*Prueba de marcadores tumorales: detecta la sobreexpresión de genes asociados con cánceres específicos (p. ej., ARNm de AFP en el cáncer de hígado).

*Monitoreo mínimo de enfermedades residuales: detecta células cancerosas residuales mínimas en el cuerpo después del tratamiento para evaluar el riesgo de recurrencia.

*Prueba de mutación genética: detecta mutaciones en genes impulsores del cáncer (p. ej., EGFR, KRAS) para guiar la terapia farmacológica dirigida.

4.Enfermedades Autoinmunes e Investigación Científica:

Se utiliza para estudiar cambios en los niveles de expresión de genes específicos durante la progresión de la enfermedad. Si bien no es un diagnóstico directo, esta tecnología es crucial para comprender los mecanismos de la enfermedad y desarrollar nuevos medicamentos.

Escenarios de aplicación

1.Diagnóstico clínico:

Departamentos de laboratorio hospitalario/laboratorios de pruebas de terceros: realizan pruebas de ácido nucleico de patógenos, detección de enfermedades genéticas, genotipado de tumores, etc. Este es actualmente el escenario de aplicación principal.

2.Prevención y Control de Enfermedades y Salud Pública:

CDC (Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades): Realizan monitoreo de epidemias, rastreo de fuentes, investigaciones de brotes y tipificación de cepas para enfermedades infecciosas.

3.Investigación científica:

Laboratorios universitarios/institutos: realizan análisis de expresión genética (para determinar si un gen está regulado hacia arriba o hacia abajo en condiciones específicas), genotipado, análisis de microARN y estudios epigenéticos (como la metilación del ADN).

4.Seguridad alimentaria y cuarentena animal:

*Detecta microorganismos patógenos (como Salmonella y E. coli) en los alimentos.

*Detectar ingredientes genéticamente modificados.

*Los puertos de entrada llevan a cabo cuarentenas de patógenos en animales y plantas para prevenir la introducción de enfermedades extrañas.

5.Ciencias Forenses:

Las huellas dactilares de ADN se utilizan para la identificación individual y las pruebas de paternidad.