Sondes d'amorce qPCR

Définition

1.qPCR (Réaction en chaîne par polymérase quantitative) - Réaction en chaîne par polymérase quantitative

*communément appelée PCR quantitative par fluorescence en temps réel.

*Il s'agit d'une technique qui utilise des signaux fluorescents pour surveiller et quantifier les modèles d'ADN/ARN en temps réel pendant le processus d'amplification PCR. Il détermine non seulement la présence du gène cible (qualitatif), mais calcule également avec précision son contenu initial (quantitatif).

2. Apprêt

*Une amorce est un court fragment d’ADN simple brin.

*Il reconnaît spécifiquement les extrémités de la séquence d'ADN cible à amplifier et sert de point de départ à la réplication de l'ADN. Considérez-le comme un « crochet » qui se verrouille spécifiquement sur le fragment cible à répliquer.

3. Sonde

*Une sonde est également un court fragment d'ADN simple brin, généralement conçu entre deux amorces.

*Une extrémité de la sonde est reliée à un rapporteur (tel que FAM) et l'autre à un extincteur.

*Lorsque les groupes extincteur et rapporteur sont à proximité (c'est-à-dire sur une sonde intacte), la fluorescence émise par le groupe rapporteur est absorbée par l'extincteur et l'instrument ne peut pas détecter le signal fluorescent.

*Pendant la PCR, l'ADN polymérase rencontre la sonde lors de la réplication de l'ADN et utilise son activité exonucléase pour hydrolyser et cliver la sonde. Cela sépare les groupes rapporteur et extincteur, et la fluorescence émise par le groupe rapporteur n'est plus éteinte, ce qui lui permet d'être détectée par l'instrument.

En résumé:

Les sondes d'amorces qPCR sont un ensemble de paires d'amorces soigneusement validées et de sondes marquées par fluorescence conçues pour les expériences de PCR quantitative en temps réel (qPCR). En travaillant ensemble, ils assurent la détection spécifique, sensible et quantitative de niveaux extrêmement faibles de séquences génétiques spécifiques dans un échantillon.

Le rôle des amorces et des sondes qPCR

1.Spécificité : Les séquences d'amorces et de sondes sont conçues sur la base de régions uniques du gène cible, garantissant que seule la cible souhaitée (telle qu'un gène viral) est amplifiée et détectée, sans détecter mal d'autres gènes non liés, évitant ainsi les faux positifs.

2. Génération de signaux : la sonde est la clé de la détection quantitative qPCR. Avec chaque brin d’ADN cible amplifié, une sonde est hydrolysée, libérant un signal fluorescent. L’intensité de la fluorescence est donc proportionnelle à la quantité de produit PCR.

3. Quantification précise : l'instrument surveille les changements du signal de fluorescence en temps réel tout au long du cycle PCR. Plus la quantité initiale de modèle dans l’échantillon est élevée, plus le nombre de cycles requis pour que le signal de fluorescence atteigne le seuil défini (valeur Ct) est faible. En comparant avec une norme de concentration connue, le nombre de copies du gène cible dans l’échantillon d’origine peut être calculé avec précision.

Lié à la maladie

La technologie amorce-sonde qPCR est pertinente pour presque toutes les maladies impliquant une infection pathogène et l’expression de gènes, et a des applications extrêmement larges.

1. Tests de maladies infectieuses (applications les plus connues) :

*Maladies virales : COVID-19 (COVID-19), grippe, VIH/SIDA, hépatite B (VHB), hépatite C (VHC), Ebola, dengue, etc. Les « tests d'acide nucléique » pendant la pandémie impliquent l'utilisation d'amorces et de sondes qPCR pour détecter l'ARN du SRAS-CoV-2.

*Maladies bactériennes : tuberculose, gonorrhée, chlamydia, identification des agents pathogènes du sepsis, etc.

*Autres agents pathogènes : paludisme, infections fongiques, etc.

2. Diagnostic des maladies génétiques :

Utilisé pour détecter les mutations, délétions ou duplications génétiques associées aux maladies génétiques. Les exemples incluent la thalassémie, l’hémophilie, la dystrophie musculaire de Duchenne et le cancer du sein héréditaire (gènes BRCA1/2).

3. Cancer :

*Test de marqueurs tumoraux : détecte la surexpression de gènes associés à des cancers spécifiques (par exemple, l'ARNm de l'AFP dans le cancer du foie).

*Surveillance minimale des maladies résiduelles : détecte un minimum de cellules cancéreuses résiduelles dans le corps après le traitement pour évaluer le risque de récidive.

*Tests de mutation génétique : détecte les mutations dans les gènes responsables du cancer (par exemple, EGFR, KRAS) pour guider un traitement médicamenteux ciblé.

4.Maladies auto-immunes et recherche scientifique :

Utilisé pour étudier les changements dans les niveaux d’expression de gènes spécifiques au cours de la progression de la maladie. Bien qu’il ne s’agisse pas d’un diagnostic direct, cette technologie est cruciale pour comprendre les mécanismes de la maladie et développer de nouveaux médicaments.

Scénarios d'application

1. Diagnostic clinique :

Départements de laboratoire hospitalier/laboratoires de tests tiers : effectuer des tests d'acide nucléique pathogène, le dépistage des maladies génétiques, le génotypage des tumeurs, etc. Il s'agit actuellement du principal scénario d'application.

2. Prévention et contrôle des maladies et santé publique :

CDC (Centers for Disease Control and Prevention) : Effectuer une surveillance des épidémies, la recherche des sources, des enquêtes sur les épidémies et le typage des souches pour les maladies infectieuses.

3.Recherche scientifique :

Laboratoires universitaires/instituts : effectuez des analyses de l'expression génique (pour déterminer si un gène est régulé positivement ou négativement dans des conditions spécifiques), le génotypage, l'analyse des microARN et des études épigénétiques (telles que la méthylation de l'ADN).

4.Sécurité alimentaire et quarantaine animale :

*Détecter les micro-organismes pathogènes (tels que Salmonella et E. coli) dans les aliments.

*Détecter les ingrédients génétiquement modifiés.

*Les points d'entrée effectuent une quarantaine des agents pathogènes sur les animaux et les plantes afin de prévenir l'introduction de maladies étrangères.

5. Sciences médico-légales :

Les empreintes génétiques sont utilisées pour l’identification individuelle et les tests de paternité.