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L'inactivation d'un gène fait référence à l'insertion d'un nouveau gène ou d'une nouvelle séquence d'ADN à un emplacement spécifique du génome. Ceci peut être réalisé grâce à la recombinaison homologue, aux vecteurs viraux ou à CRISPR/Cas9. L'inactivation génique médiée par recombinaison homologue nécessite l'introduction d'un fragment d'ADN modifié contenant la séquence génique souhaitée dans le site cible ; les vecteurs viraux, tels que les rétrovirus ou les virus adéno-associés (AAV), peuvent être utilisés pour introduire de nouveaux gènes dans le génome ; CRISPR/Cas9 peut également être utilisé pour insérer un gène en utilisant une matrice d'ADN de donneur ainsi que l'enzyme sgRNA et Cas9.

Guidée par un ARN guide unique (sgRNA), l'endonucléase Cas9 induit une cassure double brin (DSB) au niveau d'un locus génomique spécifique. La cellule active ensuite la voie de réparation médiée par la recombinaison homologue. En présence d'une matrice d'ADN donneur hautement homologue, la séquence donneuse est utilisée pour réparer la cassure, permettant ainsi l'insertion précise du fragment d'ADN cible dans le génome à l'emplacement souhaité.

Transfection cellulaire : le vecteur knock-in modifié est introduit dans les cellules cibles à l'aide de méthodes telles que la transfection chimique, l'électroporation ou la transduction virale. L’optimisation des conditions d’administration est essentielle pour améliorer l’efficacité d’intervention et maintenir la viabilité cellulaire.