PCR-CE signifie Polymerase Chain Reaction - Capillary Electrophorèse. Il s’agit d’une technique de biologie moléculaire hybride qui combine les capacités d’amplification à haute efficacité de la PCR avec les capacités de séparation et de détection à haute résolution du CE. La PCR est utilisée pour amplifier spécifiquement des fragments d’ADN cibles. Les produits amplifiés sont ensuite séparés et détectés par électrophorèse capillaire, permettant une analyse qualitative, quantitative ou de longueur des amplicons.
Principe de fonctionnement
Préparation des échantillons et amplification PCR : L'ADN est extrait de l'échantillon et l'amplification PCR est réalisée à l'aide d'amorces conçues pour la cible spécifique. Les marqueurs fluorescents sont souvent introduits directement pendant le processus d'amplification (par exemple, en utilisant des amorces marquées par fluorescence).
Injection d'électrophorèse capillaire : les produits de PCR sont injectés à une extrémité d'un tube capillaire.
Séparation électrophorétique : Sous un champ électrique à haute tension, les fragments d'ADN migrent à travers un polymère tamisé à l'intérieur du tube capillaire, les séparant physiquement en fonction de leur poids moléculaire.
Détection de fluorescence et analyse des données : lorsque des fragments d'ADN de différentes tailles traversent la fenêtre de détection à l'extrémité du tube capillaire, la lumière laser excite le colorant fluorescent attaché, générant un signal. Le logiciel enregistre le signal et génère un profil d'électrophorèse, l'axe horizontal représentant le temps (qui peut être converti en taille de fragment) et l'axe vertical représentant l'intensité de fluorescence. En analysant la position et la hauteur (ou la superficie) des pics, la taille et l'abondance relative des fragments cibles peuvent être déterminées.
Principales applications du PCR-CE
Analyse MSI ou STR ：
Identification médico-légale : les empreintes génétiques sont la référence en matière de tests de paternité et de développement de bases de données criminelles.
Diagnostic de tumeur : La détection de l'instabilité des microsatellites (MSI) est utilisée pour le dépistage du syndrome de Lynch et la prédiction de l'efficacité de l'immunothérapie.
Génotypage :
Analyse du polymorphisme nucléotidique unique (SNP) : Les amorces sont conçues pour amplifier les fragments contenant le site SNP, et leur spécificité de longueur peut être utilisée pour le génotypage.
Analyse du polymorphisme Indel : le génotypage est effectué directement sur la base des différences de longueur des produits PCR.
Détection de mutation : Utilisé pour détecter les mutations d'insertion/délétion connues.
Analyse de l'expression génique (quantification relative) : L'ADNc est amplifié par transcription inverse-PCR (RT-PCR), séparé par CE, et la quantification relative est effectuée en comparant la hauteur ou la surface du pic du produit amplifié d'un gène spécifique dans différents échantillons.
Analyse de la charge virale : La quantification relative de l'ADN viral est réalisée par PCR compétitive ou par étalonnage de contrôle interne.
Avantages
Haute résolution
Peut distinguer des fragments d'ADN qui diffèrent de seulement 1 à 4 pb en longueur, avec une précision bien supérieure à celle de l'électrophorèse sur gel d'agarose.
Automatisation à haut débit
Le chargement automatisé des échantillons dans des plaques de 96 ou 384 puits permet une analyse continue et sans surveillance d'un grand nombre d'échantillons, ce qui se traduit par une efficacité extrêmement élevée.
Haute sensibilité
La détection par fluorescence induite par laser (LIFD) offre une sensibilité exceptionnelle, nécessitant une charge d'échantillon minimale (niveaux nanolithiques).
Résultats numériques
Les résultats sont générés sous forme d'électrophérogrammes, fournissant des données précises, une facilité d'analyse logicielle et d'archivage, avec une grande objectivité.
Aucune préparation de gel requise
Cela évite le risque d’exposition à des agents cancérigènes tels que le bromure d’éthidium (EB) lors de l’électrophorèse sur gel d’agarose.
Limites
Quantification relative
Généralement, seule une quantification relative (par exemple, comparaison entre échantillons) est possible, et non une quantification absolue comme la qPCR.
Coût élevé
Le coût de l'instrumentation et des consommables (capillaires, gel tamisant) est supérieur à celui de l'électrophorèse sur gel classique.
Manque de surveillance en temps réel
Contrairement à la qPCR, la PCR-CE est un test de point final et ne peut être analysée qu'une fois la PCR terminée, empêchant ainsi l'observation en temps réel du processus d'amplification.
Limitation de la taille des fragments
La séparation optimale se produit généralement entre dizaines et centaines de paires de bases, et l'efficacité de la séparation peut être réduite pour les très gros fragments (> 1 000 paires de bases).
Informations limitées
Il fournit principalement des informations sur la longueur des fragments et ne peut pas détecter directement des changements spécifiques dans la séquence elle-même (comme des mutations ponctuelles qui ne modifient pas la longueur), nécessitant une intégration avec d'autres techniques (telles que le séquençage).
Conclusion
Si vous souhaitez commander, veuillez nous contacter Email : sales@cb-gene.com
En résumé, PCR-CE est une puissante technologie d’analyse des points finaux. Sa valeur fondamentale réside dans l’analyse de la taille des fragments à haute résolution et à haut débit des produits d’amplification PCR.
C'est comme si on utilisait d'abord la PCR, comme des « ciseaux de précision », pour extraire des fragments spécifiques du vaste plan d'ADN.
Ensuite, à l’aide du CE, comme un « tamis ultra-précis », les longueurs de ces fragments sont mesurées avec précision.
Bien qu'elle soit inférieure à la qPCR en termes de quantification absolue et de surveillance en temps réel, et inférieure au séquençage pour l'interprétation des informations de séquence détaillées, elle reste une plate-forme technologique de base indispensable pour les applications basées sur les différences de longueur de fragments (telles que le typage STR, MSI et InDel) en raison de son automatisation, de sa haute précision et de son débit élevé.
