पीसीआर-सीई का मतलब पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन - केशिका वैद्युतकणसंचलन है। यह एक हाइब्रिड आणविक जीव विज्ञान तकनीक है जो पीसीआर की उच्च दक्षता प्रवर्धन क्षमताओं को सीई की उच्च-रिज़ॉल्यूशन पृथक्करण और पहचान क्षमताओं के साथ जोड़ती है। पीसीआर का उपयोग विशेष रूप से लक्ष्य डीएनए अंशों को बढ़ाने के लिए किया जाता है। फिर प्रवर्धित उत्पादों को केशिका वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया जाता है और पता लगाया जाता है, जिससे एम्प्लिकॉन का गुणात्मक, मात्रात्मक या लंबाई विश्लेषण सक्षम हो जाता है।
काम के सिद्धांत
नमूना तैयार करना और पीसीआर प्रवर्धन : नमूने से डीएनए निकाला जाता है, और विशिष्ट लक्ष्य के लिए डिज़ाइन किए गए प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर प्रवर्धन किया जाता है। फ्लोरोसेंट लेबल अक्सर प्रवर्धन प्रक्रिया के दौरान सीधे पेश किए जाते हैं (उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट लेबल वाले प्राइमरों का उपयोग करके)।
केशिका वैद्युतकणसंचलन इंजेक्शन : पीसीआर उत्पादों को केशिका ट्यूब के एक छोर में इंजेक्ट किया जाता है।
इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण : एक उच्च-वोल्टेज विद्युत क्षेत्र के तहत, डीएनए के टुकड़े केशिका ट्यूब के भीतर एक छलनी बहुलक के माध्यम से स्थानांतरित होते हैं, उन्हें आणविक भार के आधार पर भौतिक रूप से अलग करते हैं।
प्रतिदीप्ति जांच और डेटा विश्लेषण : जैसे ही विभिन्न आकारों के डीएनए टुकड़े केशिका ट्यूब के अंत में डिटेक्शन विंडो से गुजरते हैं, लेजर प्रकाश संलग्न फ्लोरोसेंट डाई को उत्तेजित करता है, जिससे एक संकेत उत्पन्न होता है। सॉफ़्टवेयर सिग्नल को रिकॉर्ड करता है और एक वैद्युतकणसंचलन प्रोफ़ाइल उत्पन्न करता है, जिसमें क्षैतिज अक्ष समय का प्रतिनिधित्व करता है (जिसे टुकड़े के आकार में परिवर्तित किया जा सकता है) और ऊर्ध्वाधर अक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। चोटियों की स्थिति और ऊंचाई (या क्षेत्र) का विश्लेषण करके, लक्ष्य टुकड़ों का आकार और सापेक्ष बहुतायत निर्धारित की जा सकती है।
पीसीआर-सीई के मुख्य अनुप्रयोग
एमएसआई या एसटीआर विश्लेषण :
फोरेंसिक पहचान : डीएनए फ़िंगरप्रिंटिंग पितृत्व परीक्षण और आपराधिक डेटाबेस विकास के लिए स्वर्ण मानक है।
ट्यूमर निदान : माइक्रोसैटेलाइट अस्थिरता (एमएसआई) का पता लगाने का उपयोग लिंच सिंड्रोम स्क्रीनिंग और इम्यूनोथेरेपी प्रभावकारिता भविष्यवाणी के लिए किया जाता है।
जीनोटाइपिंग :
एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) विश्लेषण : प्राइमर को एसएनपी साइट वाले टुकड़ों को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया गया है, और उनकी लंबाई विशिष्टता का उपयोग जीनोटाइपिंग के लिए किया जा सकता है।
इंडेल बहुरूपता विश्लेषण : जीनोटाइपिंग सीधे पीसीआर उत्पाद की लंबाई में अंतर के आधार पर की जाती है।
उत्परिवर्तन का पता लगाना : ज्ञात सम्मिलन/विलोपन उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है।
जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण (सापेक्ष परिमाणीकरण) : सीडीएनए को रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पीसीआर (आरटी-पीसीआर) द्वारा प्रवर्धित किया जाता है, जिसे सीई द्वारा अलग किया जाता है, और विभिन्न नमूनों में एक विशिष्ट जीन के प्रवर्धित उत्पाद की चरम ऊंचाई या क्षेत्र की तुलना करके सापेक्ष परिमाणीकरण किया जाता है।
वायरल लोड विश्लेषण : वायरल डीएनए की सापेक्ष मात्रा का निर्धारण प्रतिस्पर्धी पीसीआर या आंतरिक नियंत्रण अंशांकन द्वारा किया जाता है।
लाभ
उच्च संकल्प
एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन की तुलना में कहीं अधिक सटीकता के साथ, लंबाई में केवल 1-4 बीपी के अंतर वाले डीएनए टुकड़ों को अलग कर सकता है।
उच्च-थ्रूपुट स्वचालन
96-वेल या 384-वेल प्लेटों में स्वचालित नमूना लोडिंग बड़ी संख्या में नमूनों के अप्राप्य, निरंतर विश्लेषण की अनुमति देती है, जिसके परिणामस्वरूप अत्यधिक उच्च दक्षता प्राप्त होती है।
उच्च संवेदनशीलता
लेजर-प्रेरित प्रतिदीप्ति पहचान (एलआईएफडी) असाधारण संवेदनशीलता प्रदान करता है, जिसके लिए न्यूनतम नमूना लोडिंग (नैनोलिथिक स्तर) की आवश्यकता होती है।
डिजिटल परिणाम
परिणाम इलेक्ट्रोफेरोग्राम के रूप में आउटपुट होते हैं, जो उच्च वस्तुनिष्ठता के साथ सटीक डेटा, सॉफ्टवेयर विश्लेषण में आसानी और संग्रह प्रदान करते हैं।
किसी जेल की तैयारी की आवश्यकता नहीं है
यह एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन के दौरान एथिडियम ब्रोमाइड (ईबी) जैसे कार्सिनोजेन के संपर्क के जोखिम से बचाता है।
सीमाएँ
सापेक्ष परिमाणीकरण
आमतौर पर केवल सापेक्ष मात्रा का ठहराव (जैसे, नमूनों के बीच तुलना) संभव है, क्यूपीसीआर जैसी पूर्ण मात्रा का ठहराव नहीं।
उच्च लागत
उपकरण और उपभोग्य सामग्रियों (केशिकाएं, छलनी जेल) की लागत पारंपरिक जेल वैद्युतकणसंचलन की तुलना में अधिक है।
वास्तविक समय की निगरानी का अभाव
क्यूपीसीआर के विपरीत, पीसीआर-सीई एक समापन बिंदु परख है और पीसीआर पूरा होने के बाद ही इसका विश्लेषण किया जा सकता है, जिससे प्रवर्धन प्रक्रिया के वास्तविक समय के अवलोकन को रोका जा सकता है।
टुकड़े के आकार की सीमा
इष्टतम पृथक्करण आमतौर पर दसियों से सैकड़ों आधार जोड़े के भीतर होता है, और बहुत बड़े टुकड़ों (>1000 आधार जोड़े) के लिए पृथक्करण दक्षता कम हो सकती है।
सीमित जानकारी
यह मुख्य रूप से टुकड़े की लंबाई की जानकारी प्रदान करता है और सीधे अनुक्रम में विशिष्ट परिवर्तनों का पता नहीं लगा सकता है (जैसे कि बिंदु उत्परिवर्तन जो लंबाई में परिवर्तन नहीं करते हैं), अन्य तकनीकों (जैसे अनुक्रमण) के साथ एकीकरण की आवश्यकता होती है।
निष्कर्ष
यदि आप ऑर्डर देने में रुचि रखते हैं, तो कृपया हमसे संपर्क करें ईमेल: sales@cb-gene.com
संक्षेप में, पीसीआर-सीई एक शक्तिशाली समापन बिंदु विश्लेषण तकनीक है। इसका मुख्य मूल्य पीसीआर प्रवर्धन उत्पादों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन, उच्च-थ्रूपुट टुकड़ा आकार विश्लेषण में निहित है।
यह विशाल डीएनए ब्लूप्रिंट से विशिष्ट टुकड़ों को काटने के लिए 'सटीक कैंची' की तरह पहली बार पीसीआर का उपयोग करने जैसा है।
फिर, CE का उपयोग करके, एक 'सुपर-सटीक छलनी' की तरह, इन टुकड़ों की लंबाई सटीक रूप से मापी जाती है।
यद्यपि यह पूर्ण मात्रा निर्धारण और वास्तविक समय की निगरानी में क्यूपीसीआर से कमतर है, और विस्तृत अनुक्रम जानकारी की व्याख्या करने में अनुक्रमण से कमतर है, यह अपने स्वचालन, उच्च परिशुद्धता और उच्च थ्रूपुट के कारण टुकड़े की लंबाई के अंतर (जैसे एसटीआर, एमएसआई और इनडेल टाइपिंग) के आधार पर अनुप्रयोगों के लिए एक अनिवार्य कोर प्रौद्योगिकी मंच बना हुआ है।
