इलेक्ट्रोपोरेशन, जिसे इलेक्ट्रोपरमेबिलाइजेशन के रूप में भी जाना जाता है, न्यूक्लिक एसिड (डीएनए या आरएनए), प्रोटीन, ड्रग्स और अन्य अणुओं को कोशिकाओं में पेश करने के लिए एक अत्यधिक कुशल गैर-वायरल डिलीवरी विधि है। लघु, नियंत्रित विद्युत तरंगें कोशिका झिल्ली को क्षणिक रूप से पारगम्य बनाती हैं, जिससे इन अणुओं को ग्रहण करने में मदद मिलती है।
विद्युतीकरण के बाद, प्लास्मिड डीएनए एपीसोमल (गैर-एकीकृत) रह सकता है या, प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर, मेजबान जीनोम में एकीकृत हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप क्षणिक या स्थिर अभिव्यक्ति हो सकती है।
काम के सिद्धांत
इन विट्रो इलेक्ट्रोपोरेशन के दौरान, लक्ष्य कोशिकाओं का एक निलंबन और कोशिकाओं में पेश किए जाने वाले प्लास्मिड डीएनए को एक प्रवाहकीय समाधान में मिलाया जाता है और एक क्युवेट (चित्र 1) में रखा जाता है। इलेक्ट्रोपोरेशन क्युवेट के नमूना कक्ष में दोनों तरफ दो धातु की प्लेटें होती हैं, जो विद्युत प्रवाह को मिश्रण से गुजरने की अनुमति देती हैं। क्यूवेट को इलेक्ट्रोपोरेटर के कक्ष में रखा जाता है, जो सर्किट को पूरा करने के लिए उपयुक्त विद्युत संपर्कों से सुसज्जित होता है। इलेक्ट्रोपोरेटर पर नियंत्रक उपयोगकर्ता को वितरित विद्युत पल्स के वोल्टेज, तरंग रूप और अवधि को सेट करने की अनुमति देता है। सेल व्यवहार्यता को बनाए रखते हुए कुशल वितरण प्राप्त करने के लिए इन मापदंडों को विशिष्ट सेल प्रकार के अनुसार अनुकूलित किया गया है।
चित्र 1: क्युवेट के साथ इलेक्ट्रोपोरेटर के मुख्य घटकों का योजनाबद्ध आरेख। छवि क्रेडिट: रिचर्ड व्हीलर
एक विद्युत पल्स कोशिका झिल्ली के फॉस्फोलिपिड बाईलेयर को बाधित करता है, जिससे छिद्र बनते हैं (चित्र 2)। यह प्रक्रिया असममित है, जिसमें शुरुआत में कोशिका के एनोडिक पक्ष पर छिद्र बनते हैं। साथ ही, ट्रांसमेम्ब्रेन क्षमता बढ़ जाती है। यह आवेशित अणुओं (जैसे प्लास्मिड डीएनए) को शुरू में कोशिका के कैथोडिक पक्ष की झिल्ली से चिपकने के लिए बाध्य करता है और फिर इन छिद्रों से होकर कोशिका में प्रवेश करता है (चित्र 3)।
चित्र 2: विद्युतीकरण के दौरान कोशिका झिल्ली के विघटन और छिद्र निर्माण का योजनाबद्ध आरेख। छवि स्रोत: प्रौद्योगिकी नेटवर्क।
चित्र 3: कोशिकाओं में विदेशी सामग्री (इस मामले में, एक प्लास्मिड) को पेश करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन के दौरान चरणों और संबंधित शुल्कों को दर्शाने वाला योजनाबद्ध आरेख। छवि स्रोत: प्रौद्योगिकी नेटवर्क।
सेवा के लाभ और सीमाएँ
अपेक्षाकृत सरल
इलेक्ट्रोपोरेशन विधि निष्पादित करना सरल है
असरदार
चुनौतीपूर्ण कोशिका प्रकारों पर प्रभावी
कोई वेक्टर आवश्यकता नहीं
या किसी वेक्टर की भी आवश्यकता नहीं है
कम निर्भरता
कोशिका प्रकार पर कम निर्भरता
शीघ्र अभिकर्मक
अपेक्षाकृत कम लागत पर बड़ी संख्या में सेल
ट्रांसफ़ेक्ट प्रजातियाँ
कोशिका भित्ति से प्रजातियों को संक्रमित कर सकता है
विशिष्ट उपकरण
पैरामीटर्स को सावधानीपूर्वक अनुकूलित किया जाना चाहिए
महत्वपूर्ण कोशिका क्षति
कुछ कोशिकाएँ ठीक होने से पहले ही मर जाती हैं
मुख्य पैरामीटर
इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल विकसित करते समय, उचित मापदंडों का चयन करना महत्वपूर्ण है जो कोशिका झिल्ली के विघटन को कम करते हुए पारगम्यता प्राप्त करते हैं, जिससे सेल व्यवहार्यता, प्रयोगात्मक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता और दक्षता को अधिकतम किया जाता है। विचार करने योग्य कारकों में शामिल हैं:
1. तरंग रूप: तेजी से क्षयकारी पल्स बनाम वर्ग तरंग पल्स
एक वर्ग तरंग पल्स तेजी से एक निर्धारित वोल्टेज तक बढ़ जाती है, उस वोल्टेज को बनाए रखती है, और फिर पल्स के अंत में तेजी से कट जाती है; तेजी से क्षय होने वाली नाड़ी तेजी से लक्ष्य वोल्टेज तक बढ़ती है और फिर समय के साथ कम हो जाती है। आम तौर पर, स्तनधारी अभिकर्मक के लिए वर्ग तरंग दालों को प्राथमिकता दी जाती है।
2. पल्स अवधि: स्क्वायर वेव पल्स के लिए, अवधि आमतौर पर सीधे निर्धारित की जाती है; तेजी से क्षय होने वाली दालों के लिए, समय के साथ वोल्टेज धीरे-धीरे कम हो जाता है, जिसे आमतौर पर समय स्थिरांक (टीसी) के रूप में व्यक्त किया जाता है। कोशिकाओं को होने वाली क्षति की मात्रा के आधार पर इसे अनुकूलित करने की आवश्यकता है।
3. फ़ील्ड स्ट्रेंथ: यह इलेक्ट्रोड गैप पर लागू वोल्टेज को संदर्भित करता है। यह वोल्टेज कई कारकों पर निर्भर करता है, जैसे क्युवेट गैप, सेल आकार और तापमान
4. बफर: बफर का प्रतिरोध, नमक सांद्रता और बफरिंग क्षमता सभी इलेक्ट्रोट्रांसफर दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, कुछ संवेदनशील कोशिकाएँ भिन्न संस्कृति माध्यम संरचना को पसंद करती हैं।
5. तापमान: उच्च शक्ति आम तौर पर कम तापमान को बढ़ावा देती है, जैसे कि बर्फ पर काम करना।
6. पीएच परिवर्तन: इलेक्ट्रोड पर इलेक्ट्रोलिसिस पीएच परिवर्तन का कारण बन सकता है, जिसे बफर का उपयोग करके समायोजित किया जा सकता है।
7. सेल नंबर: अत्यधिक भीड़भाड़ से जलन हो सकती है, जबकि अत्यधिक सांद्रता सकारात्मक दर को कम कर सकती है।
8. सेल की गुणवत्ता: क्योंकि इलेक्ट्रोट्रांसफर स्वाभाविक रूप से कोशिकाओं के लिए हानिकारक है, इसलिए इलेक्ट्रोपोरेट की जाने वाली कोशिकाओं की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है। आम तौर पर, स्वस्थ, अदूषित, सक्रिय रूप से विभाजित होने वाली और कम मार्ग वाली कोशिकाओं का चयन किया जाना चाहिए।
9. प्लास्मिड गुणवत्ता: खराब गुणवत्ता या दूषित प्लास्मिड डीएनए इलेक्ट्रोट्रांसफर दक्षता को कम कर सकता है।
अन्य कारक: नमी, उच्च नमक सांद्रता, और क्युवेट सतह पर बुलबुले, ये सभी उभार का कारण बन सकते हैं।
क्षणिक अभिव्यक्ति और स्थिर एकीकरण
सामान्य प्लास्मिड ट्रांसफ़ेक्शन विधियों में एक विशिष्ट, साइट-विशिष्ट एकीकरण तंत्र का अभाव होता है। इसलिए, जब एक प्लास्मिड को कोशिका नाभिक में पहुंचाया जाता है, तो एकीकरण यादृच्छिक रूप से होता है, और प्लास्मिड का केवल एक छोटा सा हिस्सा सेलुलर प्रतिकृति के दौरान डीएनए ब्रेक द्वारा मरम्मत किया जाता है और मेजबान क्रोमोसोमल जीनोम में एकीकृत किया जाता है।
इस प्रकार, हम कई प्रमुख विशेषताओं का सारांश प्रस्तुत करते हैं:
1
यादृच्छिक एकीकरण से एकीकरण दक्षता कम हो जाती है, और सक्रिय ट्रांसक्रिप्शनल क्षेत्रों में एकीकरण हमेशा संभव नहीं होता है;
2
एकीकृत प्लास्मिड की एक महत्वपूर्ण मात्रा (उदाहरण के लिए, PCDNA3.1 वेक्टर और 3000bp लक्ष्य जीन के लिए 5 μg के 1x10e6 ट्रांसफ़ेक्शन का उपयोग करके, लगभग 5.37*10e11) कोशिकाओं के विभाजित होने पर प्रतियों की संख्या धीरे-धीरे कम या ख़राब हो जाती है।
3
क्षणिक अभिव्यक्ति का शिखर आम तौर पर 24-96 घंटों के भीतर होता है
4
सकारात्मक कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एकीकृत प्रतियों को एंटीबायोटिक स्क्रीनिंग से गुजरना होगा, और बाद में प्रतिरोध रखरखाव की आवश्यकता होगी
5
क्योंकि एकीकरण डीएनए ब्रेक की मरम्मत और पुनर्संयोजन के माध्यम से होता है, बाद में इस साइट पर और ब्रेक की संभावना होती है, जो संभावित रूप से लक्ष्य जीन को बाधित करता है। इसलिए, स्थिरता एक चुनौती है. एक मोनोक्लोनल स्थिर सेल लाइन विकसित करने और मार्ग के माध्यम से स्थिरता विश्लेषण करने की सिफारिश की जाती है।
6
रेखीय डीएनए वृत्ताकार डीएनए की तुलना में अधिक कुशलता से एकीकृत होता है, लेकिन वृत्ताकार डीएनए की तुलना में इसे वितरित करना अधिक कठिन होता है।
7
विभिन्न कोशिका प्रकार महत्वपूर्ण अंतर प्रदर्शित करते हैं, जो वितरण और एकीकरण दोनों में प्रकट होते हैं
8
वितरित प्लास्मिड एंडोटॉक्सिन से मुक्त होना चाहिए, क्योंकि एंडोटॉक्सिन प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का कारण बन सकता है।
9
10
अनुप्रयोग परिदृश्य
क्षणिक अभिकर्मक
क्षणिक हाई-कॉपी/सुपरकॉपी प्रोटीन अभिव्यक्ति की तलाश
स्थिर सेल लाइन निर्माण
कम जैव सुरक्षा स्तर और एकीकरण दक्षता और स्थान के लिए कम कठोर आवश्यकताओं के साथ
पुनः संयोजक प्रोटीन उत्पादन
चिकित्सीय एंटीबॉडी और एंजाइम, हार्मोन और साइटोकिन्स का उत्पादन...
स्थिर सेल लाइन निर्माण सेवाएँ
सीबी-जीन 'प्लास्मिड इलेक्ट्रोपोरेशन इंटीग्रेशन सिस्टम' पर आधारित स्थिर सेल लाइन विकास सेवाएं प्रदान करता है। आज तक, हमने इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित जीनोम एकीकरण में व्यापक अनुभव का प्रदर्शन करते हुए, 300 से अधिक स्थिर सेल लाइन मॉडल सफलतापूर्वक तैयार किए हैं। कृपया अपनी परियोजना आवश्यकताओं पर चर्चा करने के लिए हमसे संपर्क करें।
प्रोजेक्ट
प्लास्मिड ट्रांसफेक्शन-इलेक्ट्रोपोरेशन
सेल प्रयोज्यता
लगभग सभी सेल लाइनें
दक्षता
माध्यम
यादृच्छिक एकीकरण
वाई
जैव सुरक्षा स्तर
बीएल 1
जीन ट्रांसडक्शन क्षमता
-
चयन के बाद सकारात्मक दर
उच्च
समय रेखा
जीन संश्लेषण और प्लास्मिड निर्माण
4-5 सप्ताह
वायरस पैकेज
-
पूल स्थिर सेल चयन
1-2 सप्ताह
मोनोक्लोनल सेल >
3 सप्ताह
कुल
> 8-10 सप्ताह
कार्यभार
मध्यम
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