एफएलपी-एफआरटी साइट-विशिष्ट एकीकरण प्रणाली

सीबी-जीन का प्रश्न 1 : आमतौर पर यह माना जाता है कि इस निर्माण चरण के दौरान, एफआरटी कोशिका के ट्रांसक्रिप्शनल रूप से सक्रिय क्षेत्र में एकीकृत हो जाएगा। इसका मतलब यह है कि पुनः संयोजक बहिर्जात लक्ष्य जीन की बाद की अभिव्यक्ति के लिए, यह एकीकरण कदम बहिर्जात प्रोटीन की अतिअभिव्यक्ति के लिए एक निश्चित डिग्री का आश्वासन प्रदान करता है।

 

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सीबी-जीन का प्रश्न 2 : एक पारंपरिक प्लास्मिड ट्रांसफ़ेक्शन प्रोटोकॉल में, कितनी प्रतियों को मेजबान सेल में एकीकृत किया जा सकता है? प्रतियों की इष्टतम संख्या क्या है? सामान्यतया, एफएलपी-एफआरटी मातृ कोशिकाओं का निर्माण करते समय, अभिकर्मक के बाद एकीकरण यादृच्छिक रूप से होता है, जिसका अर्थ है कि कई प्रतियों को मेजबान कोशिका में विभिन्न गुणसूत्र स्थानों में एकीकृत किया जाएगा। जितनी अधिक प्रतियां एकीकृत होंगी, लक्ष्य जीन के पुनर्संयोजित और एकीकृत होने की संभावना उतनी ही अधिक होगी, जो उच्च अभिव्यक्ति का संकेत देता है। हालाँकि, लक्ष्य जीन को पुनर्संयोजित करते समय, एकाधिक प्रतियों की एकीकरण दक्षता 100% नहीं हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप मिश्रित क्लोन (क्लोन के बीच असंगत अभिव्यक्ति स्तर) होते हैं। कभी-कभी, लक्ष्य प्रोटीन के लिए जिन्हें उच्च अभिव्यक्ति की आवश्यकता नहीं होती है, केबाई एकल एकीकृत प्रतिलिपि के साथ क्लोन का चयन करने की सलाह देते हैं। इस तरह, कोई भी क्लोन जो प्रतिरोध स्क्रीनिंग से गुजरता है, सिद्धांत रूप में, एक एकल क्लोन है, जो कमजोर पड़ने वाले क्लोनिंग को सीमित करने की आवश्यकता को समाप्त करता है। 

 

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सीबी-जीन की आंतरिक स्पॉट एफएलपी-एफआरटी कोशिकाएं

 

2. लक्ष्य जीन का एकीकरण:

लक्ष्य जीन युक्त एक अभिव्यक्ति वेक्टर और एफएलपी रीकॉम्बिनेज़ युक्त अभिव्यक्ति वेक्टर को चरण 1 से कोशिकाओं में सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया जाता है। एफएलपी रीकॉम्बिनेज़ मेजबान जीनोम और अभिव्यक्ति वेक्टर में एफआरटी साइटों के बीच साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन की मध्यस्थता करता है, लक्ष्य जीन के एकीकरण को प्राप्त करता है और प्रमोटर के नियंत्रण में स्थिर अभिव्यक्ति को सक्षम करता है।

 

वाहक 1:

एफएलपी रीकॉम्बिनेज़ की अत्यधिक अभिव्यक्ति, किसी प्रतिरोध की आवश्यकता नहीं, किसी स्थिर एकीकरण की आवश्यकता नहीं

 

 

वाहक 2:

इसमें लक्ष्य जीन और दूसरा प्रतिरोध जीन चयन मार्कर शामिल है

 

 

पुनर्गठन प्रक्रिया ：

 

 

अंतिम गठन :

पुनर्संयोजन के बाद, सकारात्मक कोशिकाओं को दूसरे प्रतिरोध जीन के माध्यम से चुना जा सकता है, और कोशिकाएं प्रतिरोध जीन -2 के प्रति सहनशील और प्रतिरोध जीन -1 के प्रति संवेदनशील होती हैं।