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डीपीसीआर परीक्षण सेवा

ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर

सेवा सिद्धांत

ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर (डीडीपीसीआर) बायो-रेड द्वारा विकसित एक डिजिटल पीसीआर विधि है जो पानी-तेल इमल्शन ड्रॉपलेट प्रणाली का उपयोग करती है। इस प्रणाली में, नमूने को हजारों नैनोलीटर आकार की बूंदों में विभाजित किया जाता है, प्रत्येक एक व्यक्तिगत प्रतिक्रिया कक्ष के रूप में कार्य करता है, एक टेस्ट ट्यूब के समान या पीसीआर प्लेट में अच्छी तरह से लेकिन बहुत छोटे पैमाने पर। यह व्यापक नमूना विभाजन डीडीपीसीआर की एक प्रमुख विशेषता है, जो लक्ष्य डीएनए अणुओं की सटीक और पूर्ण मात्रा का ठहराव सक्षम करता है।
बुनियादी सिद्धांतों से, यह देखना मुश्किल नहीं है कि डीडीपीसीआर का सबसे बड़ा लाभ पूर्ण मात्रा का ठहराव है, जिसे इस प्रकार व्यक्त किया गया है:

पूर्ण परिमाणीकरण

डीडीपीसीआर एक मानक वक्र की आवश्यकता के बिना प्रति नमूना लक्ष्य डीएनए की पूर्ण गणना प्रदान करता है, जिससे यह लक्ष्य डीएनए को मापने, वायरल लोड का विश्लेषण करने और माइक्रोबियल आबादी की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक आदर्श तकनीक बन जाती है।

उच्चा परिशुद्धि

डीडीपीसीआर द्वारा प्रदान किए गए बड़ी संख्या में नमूना असाइनमेंट नमूने में लक्ष्य डीएनए अनुक्रम की प्रतिलिपि संख्या में छोटे अंतर को विश्वसनीय रूप से माप सकते हैं।

बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात

हाई-कॉपी टेम्प्लेट और बैकग्राउंड डीएनए को पतला किया जाता है, जिससे लक्ष्य-सकारात्मक विभाजन में टेम्प्लेट अणुओं की सांद्रता बढ़ जाती है। यह ±10% की मात्रात्मक सटीकता, एकल न्यूक्लिक एसिड अणु तक संवेदनशीलता और 0.001% जितनी कम पहचान सीमा के साथ दुर्लभ लक्ष्यों का संवेदनशील पता लगाने में सक्षम बनाता है।

पीसीआर पूर्वाग्रह को दूर करें

क्यूपीसीआर प्रवर्धन दक्षता निर्भरता को खत्म करें, त्रुटि दर को कम करें, और छोटे (1.2 गुना) अंतर का पता लगाएं, यहां इसे इंगित किया जाना चाहिए।

उपभोज्य लागत में कमी

पिकोलिटर से नैनोलीटर रेंज में प्रतिक्रिया मात्रा प्रति डेटा बिंदु पर अभिकर्मक उपयोग और नमूना मात्रा को कम करती है, खासकर कीमती नमूनों के लिए।

उत्कृष्ट विभाजन

डीडीपीसीआर प्रति 20 μl नमूने में लगभग 20,000 बूंदें उत्पन्न करता है, जिससे 96-वेल प्लेट पर लगभग 2 मिलियन विभाजित पीसीआर प्रतिक्रियाएं होती हैं। अधिक से अधिक विभाजन सीधे परिमाणीकरण परिशुद्धता को बढ़ाता है।

सेवा आवेदन

ट्यूमर के क्षेत्र के साथ मिलकर, हमारे पास आम तौर पर इससे संबंधित 4 अनुप्रयोग हैं:
डीपीसीआर परीक्षण सेवा अनुप्रयोग
  जीन अभिव्यक्ति का पता लगाना, मुख्य रूप से एमआरएनए पता लगाने का मात्रात्मक विश्लेषण।
  उत्परिवर्तन का पता लगाएं (एसएनवी और इंडेल), प्रतिलिपि संख्या का पता लगा सकते हैं, और अनुपात का भी पता लगा सकते हैं।
  फ़्यूज़न का पता लगा सकता है, कॉपी नंबर का पता लगा सकता है, और अनुपात का भी पता लगा सकता है।
  सीएनवी का पता लगाना (कॉपी संख्या भिन्नता विश्लेषण), सापेक्ष मात्रा का ठहराव।

केस प्रस्तुतिकरण

सीबी-जीन उपरोक्त अनुप्रयोगों के लिए संबंधित डिटेक्शन किट विकसित करता है, और किट के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए सीबी-जीन के संदर्भ उत्पादों का उपयोग करता है। आइए उदाहरण के तौर पर EGFR T790M लें:
  • प्रयोग 1: एलओबी रिक्त सीमा परीक्षण
    परीक्षण किए जाने वाले नमूने: 20 नकारात्मक नमूने और 1 एनटीसी। इनपुट मात्रा क्रमशः 10ng और 40ng पर सेट की गई थी, और प्रत्येक नमूने का परीक्षण बायो-रेड डिजिटल पीसीआर द्वारा दो प्रतियों में किया गया था।
     
    नमूना 10ng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 एनटीसी
    एन=1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1.2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    एन=2 0 0 0 0 0 0 0 0.6 0 0 0 0 0 0.8 0 0 0 0 0 0 0
     
    नमूना 40ng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 एनटीसी
    एन=1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1.3 0 0 0 0 0 0 0 0.9 0 0 0
    एन=2 0 0 0 0.7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
     
    उपरोक्त डेटा से, यह देखा जा सकता है कि चाहे वह 10ng हो या 40ng, LOB को 2 प्रतियों के भीतर नियंत्रित किया जाता है (आमतौर पर शोर प्रतियां 5 के भीतर होती हैं), और शोर खुराक पर निर्भरता नहीं दिखाता है और एक यादृच्छिक रूप से उत्पन्न शोर संकेत है।
  • प्रयोग 2: सटीकता परीक्षण
    परीक्षण किए जाने वाले नमूने: एनजीएस द्वारा सकारात्मक रूप से सत्यापित 10 नमूने (संख्या 1-10); एनजीएस द्वारा सत्यापित 10 नमूने नकारात्मक (क्रमांक 11-20)। 20 नमूनों का परीक्षण करने के लिए डिजिटल पीसीआर का उपयोग किया गया था।
     
    नमूना 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
    कीमत 72.21% 66.63% 13.25% 5.29% 10.34% 43.01% 22.19% 3.27% 1.07% 13.29%

    परिणाम

    		 सकारात्मक सकारात्मक सकारात्मक सकारात्मक सकारात्मक सकारात्मक सकारात्मक सकारात्मक सकारात्मक सकारात्मक
     
    नमूना 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
    कीमत 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
    परिणाम नकारात्मक नकारात्मक नकारात्मक नकारात्मक नकारात्मक नकारात्मक नकारात्मक नकारात्मक नकारात्मक नकारात्मक

    उपरोक्त आंकड़ों से, हम देख सकते हैं कि:
    ① 10 एनजीएस सकारात्मक नमूनों का परीक्षण करें, परीक्षण के परिणाम सभी सकारात्मक हैं, सकारात्मक अनुपालन दर 100% है, और भिन्नता आवृत्ति मात्रात्मक रूप से पता चला है।
    ② 10 एनजीएस नकारात्मक नमूनों का परीक्षण करें, परीक्षण के परिणाम सभी नकारात्मक हैं, नकारात्मक अनुपालन दर 100% है, और निश्चित भिन्नता आवृत्ति 0% है।
  • प्रयोग 3: रैखिक सीमा परीक्षण
    1. इनपुट राशि और प्रतिलिपि संख्या और आवृत्ति के बीच रैखिक परीक्षण
    सबसे पहले, 50% की उत्परिवर्तन आवृत्ति के साथ ईजीएफआर टी790एम मानक (सीबीपी10402) का चयन करें। यह मानक जीन संपादन द्वारा संपादित CN=2 वाला दो-एलील जीन है। एक है म्यूटेशन और दूसरा है डब्ल्यूटी. सैद्धांतिक मूल्य गणना, सेंगर अनुक्रमण और बायो-रेड डीडीपीसीआर किट (परख आईडी: dHsaCP2000019) के बाद, इसकी 50% आवृत्ति होने की पुष्टि की जाती है।
    1.1 0.1एनजी और 200एनजी इनपुट मात्रा के बीच 10 ग्रेडिएंट सेट करें, और यह विचार करने के लिए डिजिटल पीसीआर डिटेक्शन (2 प्रतिकृति) करें कि क्या एफएएम कॉपी संख्या इनपुट राशि से रैखिक रूप से संबंधित है और क्या वीआईसी कॉपी संख्या इनपुट राशि से रैखिक रूप से संबंधित है;
    1.2 0.1ng और 200ng इनपुट मात्रा के बीच 10 ग्रेडिएंट सेट करें, और यह निर्धारित करने के लिए डिजिटल पीसीआर डिटेक्शन (2 प्रतिकृति) करें कि क्या %AF=50±10% का उतार-चढ़ाव संतुष्ट है।
     
    इनपुट एन.जी 200 100 50 20 10 5 2 1 0.5 0.1
    FAM प्रतियां(n=1) 18970 14970 7238 3327 1570 786 288 139 87 23
    FAM प्रतियां(n=2) 18367 15013 7139 3122 1430 722 290 151 67 21
    वीआईसी प्रतियां(एन=1) 20183 15180 7312 3290 1540 739 267 150 93 31
    वीआईसी प्रतियां(एन=2) 19783 14962 7016 3017 1510 697 281 143 80 30
     
    इनपुट एन.जी 200 100 50 20 10 5 2 1 0.5 0.1
    एएफ%(एन=1) 48.45 49.65 49.75 50.28 50.48 51.54 51.89 48.10 48.33 42.59
    एएफ%(एन=2) 48.14 50.09 50.43 50.86 48.64 50.88 50.79 51.36 45.58 41.18
     
    उपरोक्त डेटा से, हम देख सकते हैं कि:
    ①200 एनजी इनपुट बहुत बड़ा है, कॉपी संख्या रैखिक नहीं है, हालांकि यह 45-55% की सीमा को पूरा करती है, यह एकल चैनल कॉपी संख्या निर्धारण के लिए उपयुक्त नहीं है;
    ②0.1 एनजी इनपुट बहुत छोटा है, कॉपी संख्या रैखिक नहीं है, और 42.59% भी 45% से कम है, जो एकल चैनल या दोहरे चैनल के लिए उपयुक्त नहीं है;
    इसलिए: सीमा 0.5-100ng है

    2. रैखिक कमजोर पड़ने की विभिन्न आवृत्तियों पर सैद्धांतिक मूल्यों और पहचान मूल्यों का रैखिक परीक्षण
    उपरोक्त निष्कर्षों के आधार पर, हमने %AF रैखिक रेंज की आगे की खोज के रूप में 10ng का चयन किया। सबसे पहले, हमने ईजीएफआर टी790एम के संबंधित नकारात्मक मानक का उपयोग किया, मानक के 50% पर सीमित कमजोर पड़ने का प्रदर्शन किया, 0.1% और 50% के बीच 9 एएफ ग्रेडिएंट सेट किए, और डिजिटल पीसीआर डिटेक्शन (2 प्रतिकृति) का प्रदर्शन किया।
    अपेक्षित %AF 50±10% 25±10% 10±10% 5±20% 3±20% 1±30% 0.5±30% 0.2±30% 0.1±50%
    %AF(n=1) 49.14 24.82 9.82 4.52 2.94 0.95 0.55 0.16 0.13
    %AF(n=2) 50.25 26.20 10.24 4.98 2.55 0.79 0.59 0.19 0.13
     
    उपरोक्त डेटा से, हम देख सकते हैं कि 10 एनजी के इनपुट पर, एएफ% कुछ उतार-चढ़ाव के साथ बहुत अच्छा रैखिक कमजोर पड़ने को दर्शाता है, लेकिन सभी त्रुटि सीमा के भीतर।
  • प्रयोग 4: डिटेक्शन लिमिट टेस्ट
    हम सैद्धांतिक गणना के माध्यम से संभावित पता लगाने की सीमा सीमा का अनुमान लगा सकते हैं। जब नियंत्रण प्रतिलिपि 15000 (50एनजी इनपुट के अनुरूप) के भीतर होती है, तो एलओबी डेटा 2, 2/15000=0.0133% होता है, और अनुमानित पहचान सीमा 0.0200% होती है।
    इतनी कम आवृत्ति में, नैदानिक ​​​​अनुप्रयोग परिदृश्य ctDNA के लिए उपयुक्त है। आम तौर पर, नैदानिक ​​​​अभ्यास में, 10 मिलीलीटर पूरे रक्त का माध्य ctDNA 20-40ng होता है, और सबसे कम मान 20ng होता है। 20ng का सैद्धांतिक मूल्य 6000 प्रतियां, 2/6000=0.0333% है, और अनुमानित पता लगाने की सीमा 0.0500% है।
    0.05% की त्रुटि सीमा ±50% है, जो 0.025-0.075% है, इसलिए हम 3 बिंदु चुनते हैं और क्रमशः 0.010%, 0.050% और 0.100% के एलओडी का पता लगाते हैं, जिसके लिए 95% पहचान की आवश्यकता होती है।

    0.010%
    20 नमूनों पर 0.01% के साथ डिजिटल पीसीआर परीक्षण करें, यह देखने के लिए कि क्या 0.005-0.015% के भीतर 95% का पता लगाया जा सकता है।
     
    0.05% डिजिटल पीसीआर परीक्षण किया गया था।
    यह देखने के लिए कि क्या 0.025-0.075% के भीतर 95% का पता लगाया गया था, 20 0.05% नमूनों पर

    0.1% डिजिटल पीसीआर परीक्षण किया गया था।
    यह देखने के लिए कि क्या 95% का पता 0.05-0.15% के भीतर हासिल किया गया था, 20 0.1% नमूनों पर
     
    भविष्यवाणी आवृत्ति LOD 0.01% 0.05% 0.10%
    उपलब्धि दर 65% 95% 100%

    उपरोक्त आंकड़ों से यह देखा जा सकता है कि 0.05% को डिटेक्शन किट की डिटेक्शन सीमा एलओडी के रूप में चुना गया है।
  • प्रयोग 5: परिशुद्धता परीक्षण
    डिजिटल पीसीआर जांच के लिए 2% की मजबूत सकारात्मक दर वाले 20 नमूने, 1% की मध्यम सकारात्मक दर वाले 20 नमूने और 0.2% की कमजोर सकारात्मक दर वाले 20 नमूने चुनें।
     
      उच्च सकारात्मक2% मध्यम सकारात्मक 1% कम सकारात्मक 0.2%
    औसत 1.9959% 1.0027% 0.1878%
    एसडी 0.001039 0.001135 0.000295
    सीवी% 5.2058 11.3177 15.7011
    मापन अनिश्चितता 1.16% 2.53% 3.51%

    उपरोक्त डेटा से, यह देखा जा सकता है कि मजबूत सकारात्मक 2%, मध्यम सकारात्मक 1% और कमजोर सकारात्मक 0.2% की तीन पहचान प्रणालियों के तहत, त्रुटियां सभी उचित सीमा के भीतर हैं और सटीकता अच्छी है।
  • प्रयोग 6: पुनर्प्राप्ति परीक्षण
    सबसे पहले, ईजीएफआर टी790एम के संबंधित नकारात्मक मानक का उपयोग मानक के 50% पर सीमित कमजोर पड़ने के लिए किया गया था, और प्रत्येक ग्रेडिएंट को नकारात्मक नमूने के साथ दो बार पतला किया गया था, और फिर 11 नमूनों का परीक्षण किया गया था।
    नमूना 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
    %AF 50.00 25.00 12.50 6.25 3.125 1.563 0.781 0.391 0.195 0.098 0.049
    %वसूली दर 99.0 100.1 99.4 108.8 95.6 91.1

    112.2

    		 92.4 84.8 81.3 82.1

    उपरोक्त आंकड़ों से यह देखा जा सकता है कि जब एएफ 0.05%-50% की सीमा में होता है, तो संबंधित पुनर्प्राप्ति दर 80-120% की सीमा में होती है, जो अपेक्षाओं के अनुरूप है।
  • प्रयोग 7: पुनरावर्तनीयता परीक्षण
     
    अलग-अलग एएफ (1%~50%) के साथ 10 मानक नमूने लें और ऑपरेटर ए और ऑपरेटर बी को एक ही दिन में चार परीक्षण करने की व्यवस्था करें।

    उपरोक्त आंकड़ों से यह देखा जा सकता है कि ईजीएफआर टी790एम डिटेक्शन सिस्टम स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है।
  • प्रयोग 8: पुनरुत्पादन परीक्षण
    अलग-अलग एएफ (1% ~ 50%) के साथ 10 मानक नमूने लें और ① ऑपरेटर ए और ऑपरेटर बी को एक ही दिन में चार प्रयोगात्मक परीक्षण करने की व्यवस्था करें; ② ऑपरेटर ए क्रमशः पहले दिन और दूसरे दिन चार प्रयोगात्मक परीक्षण करता है; ③ ऑपरेटर ए पहले दिन चार प्रयोगात्मक परीक्षण करता है और ऑपरेटर बी दूसरे दिन चार प्रयोगात्मक परीक्षण करता है।

    उपरोक्त आंकड़ों से यह देखा जा सकता है कि ईजीएफआर टी790एम डिटेक्शन सिस्टम अलग-अलग लोगों और अलग-अलग समय में स्थिर और पुनरुत्पादित है।
सीबी-जीन ने डीपीसीआर डिटेक्शन किट की एक श्रृंखला विकसित की है और मालिकाना मानकों का उपयोग करके उनके प्रदर्शन को मान्य किया है। ये किट जीन उत्परिवर्तन, संलयन, प्रतिलिपि संख्या भिन्नता और अन्य जीनोमिक परिवर्तनों का पता लगा सकते हैं। इसके अलावा, हम अपने ग्राहकों के लिए विश्वसनीय, उच्च गुणवत्ता वाले नमूना परीक्षण प्रदान करने के लिए पूर्ण मात्रा निर्धारण और उच्च परिशुद्धता की तकनीक के लाभों का लाभ उठाते हुए डीपीसीआर-आधारित अनुसंधान सेवाएं प्रदान करते हैं।
यदि आप ऑर्डर देने में रुचि रखते हैं, तो कृपया हमसे संपर्क करें
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