लेंटवायरस-एकीकृत स्थिर सेल लाइन्स

प्रयोगशाला लेंटिवायरस उत्पादन में जैव सुरक्षा में सुधार करने के लिए, गैर-आवश्यक वायरल घटकों को हटा दिया जाता है, और आवश्यक तत्वों को कई प्लास्मिड में वितरित किया जाता है।
इस डिज़ाइन रणनीति के परिणामस्वरूप लेंटीवायरल पैकेजिंग सिस्टम की चार व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली पीढ़ियाँ सामने आई हैं:

पहली पीढ़ी के प्लास्मिड में शामिल हैं (चित्रा 2) :
1. ट्रांसफर प्लास्मिड-इसमें ट्रांसजीन और जंगली-प्रकार के एलटीआर शामिल हैं
2. पैकेजिंग प्लास्मिड-इसमें संपूर्ण वायरल जीनोम (पैकेजिंग, नियामक और सहायक जीन) शामिल हैं, केवल लिफाफा घटा हुआ है
3. लिफाफा प्लास्मिड-इसमें पर्यावरण शामिल है।

 

चौथी पीढ़ी के प्लास्मिड में शामिल हैं (चित्र 5):

चित्र 5 चौथी पीढ़ी का लेंटीवायरल प्लास्मिड सिस्टम

 

चौथी पीढ़ी के लेंटीवायरल पैकेजिंग सिस्टम को वायरल उपज, उपयोग में आसानी और बढ़ी हुई जैव सुरक्षा के लिए अनुकूलित किया गया है। आवश्यक वायरल घटकों की उच्च-स्तरीय अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए टैट को बनाए रखते हुए, इन प्रणालियों में नियंत्रित ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण को सक्षम करने के लिए टेट्रासाइक्लिन-इंड्यूसिबल प्रमोटर्स को शामिल किया गया है। पुनर्संयोजन के जोखिम को और कम करने के लिए, गैग-प्रो और वीपीआर-पोल जैसे प्रमुख वायरल तत्वों को कई प्लास्मिड में अलग किया जाता है, जिससे आनुवंशिक पृथक्करण बढ़ता है और प्रतिकृति-सक्षम लेंटवायरस (आरसीएल) गठन की संभावना कम हो जाती है। यह डिज़ाइन उच्च स्तर की जैव सुरक्षा बनाए रखते हुए कुशल लेंटिवायरस उत्पादन को सक्षम बनाता है। चौथी पीढ़ी के सिस्टम का उपयोग करके उत्पादित असंकेंद्रित वायरल सतह पर तैरनेवाला 5 × 10⁸ IFU/mL तक के टाइटर्स तक पहुंचने की सूचना मिली है।

संक्षेप में, क्रमिक डिजाइन सुधारों के माध्यम से, चौथी पीढ़ी के लेंटिवायरल पैकेजिंग सिस्टम को प्रयोगशाला सेटिंग्स में व्यापक रूप से अपनाया गया है, जो सुरक्षा, प्रयोज्यता और उच्च वायरल उपज का इष्टतम संतुलन प्रदान करता है।

 

1. लेंटवायरस पैकेजिंग के लिए निर्माता सेल लाइन के चयन की आवश्यकता होती है। HEK293T आमतौर पर उपयोग किया जाता है। HEK293 की तुलना में, HEK293T कोशिकाएं SV40 बड़े T एंटीजन को व्यक्त करती हैं, जिससे SV40 प्रतिकृति मूल वाले प्लास्मिड को एपिसोडिक रूप से दोहराने की अनुमति मिलती है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च प्रतिलिपि संख्या होती है। HEK293T कोशिकाओं में उच्च अभिकर्मक दक्षता भी होती है और उच्च वायरल टाइटर्स का समर्थन करती है।

2. 293T/17 293T कोशिकाओं का एक उपक्लोन है जो SV40 बड़े T एंटीजन को भी व्यक्त करता है। क्लोन 17 को परीक्षण में इसकी उच्च अभिकर्मक दक्षता के लिए चुना गया था।

3. 293FT भी 293T कोशिकाओं का व्युत्पन्न है, एक तेजी से बढ़ने वाला वैरिएंट जो SV40 बड़े T एंटीजन को भी व्यक्त करता है।

4. लेंटी-एक्स 293 कोशिकाएं भी 293टी कोशिकाओं का व्युत्पन्न हैं जो एसवी40 बड़े टी एंटीजन को व्यक्त करती हैं। यह बताया गया है कि लेंटी-एक्स 293 कोशिकाएं 293एफटी कोशिकाओं की तुलना में छह गुना अधिक लेंटीवायरस पैकेज कर सकती हैं। 

 

5. सस्पेंशन 293T सेल और विभिन्न सस्पेंशन सेल डेरिवेटिव। सस्पेंशन कोशिकाएं उच्च घनत्व प्राप्त कर सकती हैं और बायोरिएक्टर तक विस्तारित की जा सकती हैं। वे सीरम-मुक्त हैं, जो डाउनस्ट्रीम शुद्धि और एकाग्रता की सुविधा प्रदान करते हैं।

6. स्थिर उत्पादन सेल लाइनें, आवश्यक पैकेजिंग घटकों को होस्ट में स्थिर रूप से एकीकृत करने के साथ, उत्पादन प्रक्रिया को सरल बनाती हैं और वायरस की बैच स्थिरता सुनिश्चित करती हैं, जिससे क्षणिक अभिकर्मक के लिए आवश्यक व्यक्तिगत पैकेजिंग की आवश्यकता समाप्त हो जाती है।

चित्र 6 लेंटवायरस पैकेजिंग आरेख

लक्ष्य कोशिकाओं के कुशल पारगमन के लिए उच्च-अनुमापांक और उच्च-शुद्धता वाली लेंटीवायरल तैयारी आवश्यक हैं। इसलिए, एकत्र किए गए वायरल सतह पर तैरनेवाला को आमतौर पर डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों से पहले अधिक शुद्धि और एकाग्रता की आवश्यकता होती है।

 

लेंटीवायरल सांद्रण और शुद्धिकरण के लिए कई प्रकार की विधियाँ उपलब्ध हैं। दृष्टिकोण का चुनाव नमूना मात्रा, आवश्यक शुद्धता, प्रसंस्करण समय और स्केलेबिलिटी जैसे कारकों पर निर्भर करता है। आम तौर पर इस्तेमाल की जाने वाली विधियों में सेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित तकनीक, निस्पंदन, अवक्षेपण और आत्मीयता-आधारित कैप्चर शामिल हैं। कुछ विधियाँ, जैसे कि अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन, उच्च शुद्धता प्रदान करती हैं लेकिन इसमें समय लग सकता है, जबकि अन्य, जैसे पॉलीइथाइलीन ग्लाइकोल अवक्षेपण, तेज़ हैं लेकिन समान शुद्धता प्राप्त नहीं कर सकती हैं। नई तकनीकें, जैसे कि चुंबकीय नैनोकणों का उपयोग करने वाली तकनीकें, न्यूनतम हैंडलिंग के साथ तेजी से, उच्च-उपज एकाग्रता की अनुमति देती हैं।

निम्नलिखित कुछ प्रमुख तरीकों का विस्तृत विवरण है:
1. सेंट्रीफ्यूजेशन:
विभेदक सेंट्रीफ्यूजेशन:
यह विधि आकार और घनत्व के आधार पर सेलुलर मलबे और अन्य घटकों से वायरस को अलग करने के लिए विभिन्न सेंट्रीफ्यूजेशन गति का उपयोग करती है।
अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन:
यह तकनीक वायरस को गोली मारने के लिए अत्यधिक उच्च गति का उपयोग करती है, जिससे इसे केंद्रित और शुद्ध किया जाता है।
केन्द्रापसारक अल्ट्राफिल्ट्रेशन:
यह विधि बड़े कणों को फ़िल्टर करने और वायरस को केंद्रित करने के लिए विशिष्ट आणविक भार कटऑफ के साथ झिल्ली का उपयोग करती है। 

 

2. निस्पंदन:
स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन: यह विधि एक थोक तरल से वायरल कणों को अलग करने के लिए एक झिल्ली का उपयोग करती है, जिससे निरंतर प्रवाह और एकाग्रता सक्षम होती है।
झिल्ली सोखना/क्षालन: वायरस को विशिष्ट झिल्ली फिल्टर में सोख लिया जा सकता है और फिर एक उपयुक्त बफर का उपयोग करके निस्तारित किया जा सकता है।
 

3. वर्षा:
पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) वर्षा: पीईजी का उपयोग संग्रह और एकाग्रता के लिए समाधान से वायरस को अवक्षेपित करने के लिए किया जाता है।
सहअवक्षेपण: कुछ मामलों में, एकाग्रता बढ़ाने के लिए वायरस को अन्य पदार्थों (उदाहरण के लिए, प्रोटीन) के साथ सहअवक्षेपित किया जा सकता है।
 

4. इम्यूनोकैप्चर:
एंटीबॉडी-आधारित कैप्चर: वायरस को एंटीबॉडी का उपयोग करके पकड़ा जा सकता है जो विशेष रूप से वायरस से जुड़ते हैं, अलगाव और एकाग्रता को सक्षम करते हैं।

5. अन्य तरीके:
चुंबकीय नैनोकण: इन नैनोकणों का उपयोग वायरस को पकड़ने और केंद्रित करने के लिए किया जा सकता है, जिससे तेजी से और कुशल एकाग्रता मिलती है।
ध्वनिक पृथक्करण: यह विधि आकार और घनत्व के आधार पर कणों को अलग करने के लिए ध्वनि तरंगों का उपयोग करती है, जो संभावित रूप से वायरल एकाग्रता के लिए एक सौम्य और प्रभावी विधि प्रदान करती है।
जल-आधारित संघनन: हवा में वायरस के नमूने लेने के लिए यह नई तकनीक विकसित की जा रही है।

 

वायरल टिटर एक तैयारी में संक्रामक वायरल कणों की एकाग्रता को संदर्भित करता है और लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। एकाग्रता के बाद, लगातार और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम सुनिश्चित करने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं को संक्रमित करने से पहले वायरल टाइटर्स को आम तौर पर निर्धारित किया जाता है। वायरल टिटर माप के लिए कई विधियां उपलब्ध हैं, जिनमें प्लाक परख, फोकस-गठन परख और अन्य संक्रामकता- या कण-आधारित मात्रा निर्धारण तकनीक शामिल हैं।

1. प्लाक परख:
इस विधि में वायरल नमूने के क्रमिक कमजोर पड़ने के साथ मेजबान कोशिकाओं के एक मोनोलेयर को संक्रमित करना शामिल है।
ऊष्मायन के बाद, दृश्यमान प्लाक (कोशिका लसीका या मृत्यु के क्षेत्र) बनते हैं, और प्लाक की संख्या की गणना की जाती है।
टिटर की गणना प्लाक की संख्या, कमजोर पड़ने वाले कारक और उपयोग किए गए वायरस की मात्रा के आधार पर की जाती है।

2. फोकस परख:
प्लाक परख के समान, यह विधि संक्रमण के बाद बनने वाले फॉसी (संक्रमित कोशिकाओं के क्षेत्र) की संख्या निर्धारित करती है।
टिटर का निर्धारण फॉसी की गिनती और तनुकरण और आयतन को ध्यान में रखकर किया जाता है।

3. अन्य तरीके:
क्यूपीसीआर: वायरल आरएनए या डीएनए की मात्रा निर्धारित करता है, जिससे कुल वायरल कणों का माप मिलता है।
एलिसा: वायरल एंटीजन का पता लगाता है, वायरल लोड को मापने के लिए एक विधि प्रदान करता है।
फ्लो साइटोमेट्री: एकल संक्रमित कोशिकाओं, विशेष रूप से फ्लोरोसेंट मार्करों को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को गिनने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

चित्र 7. लेंटीवायरल पैकेजिंग सुपरनैटेंट में मौजूद उत्पाद

 

भौतिक विधियाँ सतह पर तैरनेवाला में छोड़े गए कार्यात्मक और गैर-कार्यात्मक कणों के साथ-साथ मुक्त कैप्सिड प्रोटीन (उदाहरण के लिए, पी 24) को माप सकती हैं। कार्यात्मक अनुमापन विधियाँ विशेष रूप से कार्यात्मक वायरल कणों को मापती हैं।

 

ध्यान देने योग्य महत्वपूर्ण बिंदु :
1. संक्रामक टिटर बनाम भौतिक टिटर:
कुछ तरीके संक्रामक वायरल कणों (संक्रामक टिटर) की संख्या को मापते हैं, जबकि अन्य वायरल कणों (भौतिक टिटर) की कुल संख्या को मापते हैं। संक्रामक टिटर वायरस की संक्रमित करने और ट्रांसड्यूस करने की क्षमता को बेहतर ढंग से दर्शाता है। हालाँकि, संक्रामक टिटर का पता लगाने में आम तौर पर अधिक समय लगता है, जबकि भौतिक टिटर का पता लगाना तेज़ होता है। इसलिए, एक प्रकार की विधि 'संक्रामक टिटर' और 'भौतिक टिटर' के बीच रूपांतरण संबंध स्थापित करती है।
 

2. प्लाक बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू), ट्रांसडक्शन इकाइयों (टीयू), और संक्रामक इकाइयों (आईएफयू) के बीच क्या अंतर है? कौन सा उपयोग किए गए सक्रिय वायरस की मात्रा को बेहतर ढंग से दर्शाता है?
1) पीएफयू (प्लाक-फॉर्मिंग यूनिट) संक्रामक या जीवित वायरस की संख्या को इंगित करता है। पीएफयू/एमएल का उपयोग वायरस संक्रमण के बाद बनने वाले प्लाक की संख्या को मापकर वायरल टिटर को कैलिब्रेट करने के लिए किया जाता है और तैयारी में सक्रिय वायरस की मात्रा को दर्शाता है।
2) आईएफयू (संक्रामक इकाई) पीएफयू के बराबर है।
3) टीयू/एमएल: ट्रांसडक्शन इकाइयां/एमएल, वायरल जहर के प्रति मिलीलीटर जैविक रूप से सक्रिय वायरल कणों की संख्या को इंगित करता है, यानी, लक्ष्य कोशिकाओं को संक्रमित करने और प्रवेश करने में सक्षम वायरल जीनोम की संख्या। यह लेंटिवायरस के लिए माप की आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली इकाई है और किसी तैयारी में काम करने वाले वायरस की मात्रा को दर्शाती है।
आईएफयू की संख्या आम तौर पर टीयू की संख्या से कम होती है क्योंकि कोशिकाओं में प्रवेश करने वाले सभी वायरल कण सफलतापूर्वक उत्पादक संक्रमण शुरू नहीं करते हैं।

 

लेंटीवायरल ट्रांसडक्शन में लक्ष्य जीन को मेजबान जीनोम में एकीकृत करना शामिल है। यह लेंटिवायरल वेक्टर के भीतर एन्कोड किए गए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और इंटीग्रेज एंजाइमों को संशोधित करके प्राप्त किया जाता है, जो बहिर्जात जीन की निरंतर अभिव्यक्ति को सक्षम करता है। अन्य वायरल वैक्टरों के विपरीत, लेंटिवायरस गैर-विभाजित कोशिकाओं को स्थानांतरित कर सकता है, जो जीन वितरण अनुप्रयोगों में अद्वितीय लाभ प्रदान करता है।

स्थिर कोशिका रेखाएँ स्थापित करने में, लेंटिवायरस मेजबान कोशिकाओं को संक्रमित करते हैं। रिवर्स-ट्रांसक्राइब्ड डीएनए कोशिकाओं में आंशिक रूप से मुक्त रहता है, जबकि इंटीग्रेज एंजाइम लेंटिवायरल वेक्टर के 5' से 3' एलटीआर अनुक्रमों को मेजबान जीनोम में एकीकृत करता है। चयनात्मक प्रतिरोध स्क्रीनिंग के तहत, गैर-एकीकृत कोशिकाओं को मार दिया जाता है, और स्थिर सेल लाइनों को स्थापित करने के लिए जीवित कोशिकाओं का विस्तार किया जा सकता है। अध्ययनों से पता चला है कि कोशिकाओं के विभाजित होने पर गैर-एकीकृत डीएनए को पूरी तरह से नष्ट होने में लगभग 10-14 दिन लगते हैं, जो प्रतिरोध के लिए दबाव स्क्रीनिंग की अवधि भी है।

लेंटीवायरस (एलवी) घिरे हुए वायरस हैं, जिनमें से सबसे आम वीएसवी-जी है। वे विशिष्ट कोशिका सतह प्रोटीन (जैसे एलडीएलआर) से जुड़कर कोशिकाओं में प्रवेश करते हैं, फिर झिल्ली संलयन से गुजरते हैं और अपनी आनुवंशिक जानकारी वाले वायरल आरएनए को साइटोप्लाज्म में इंजेक्ट करते हैं। यह एकल-फंसे वायरल आरएनए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन द्वारा डीएनए में परिवर्तित हो जाता है। वायरल डीएनए कोशिका केंद्रक में प्रवेश करता है और वायरल इंटीग्रेज द्वारा मेजबान कोशिका जीनोम में एकीकृत हो जाता है।

चित्र 8 मेजबान जीनोम में लेंटवायरस एकीकरण का योजनाबद्ध आरेख

 

1. एमओआई चयन: एक एमओआई जो बहुत कम है उसके परिणामस्वरूप कम पारगमन दक्षता होगी, जबकि एक एमओआई जो बहुत अधिक है वह साइटोटोक्सिसिटी का कारण बन सकता है। इष्टतम संक्रमण स्थितियों को निर्धारित करने के लिए एमओआई अनुमापन प्रयोग आवश्यक हैं।

2. पॉलीब्रिन का उपयोग: पॉलीब्रिन एक पॉलीकेशन है जो वायरस और कोशिका झिल्ली के बीच चार्ज प्रतिकर्षण को कम करता है, जिससे ट्रांसडक्शन दक्षता में सुधार होता है। हालाँकि, यदि खुराक अनुचित है, तो इससे कोशिका क्षति भी हो सकती है।

3. समय: जैसे ही सेल व्यवहार्यता ठीक हो जाए, ट्रांसडक्शन किया जाना चाहिए, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोशिकाएं जल्द से जल्द सक्रिय प्रसार चरण में हैं।

4. सेल घनत्व नियंत्रण: अत्यधिक उच्च सेल घनत्व पारगमन लागत को बढ़ाता है, जबकि अत्यधिक कम घनत्व दक्षता को प्रभावित कर सकता है। लगभग 1-2 × (10^5) सेल/एमएल का सेल घनत्व बनाए रखने की अनुशंसा की जाती है।

5. वायरल एकाग्रता और टिटर: लेंटवायरस टिटर सीधे ट्रांसडक्शन दक्षता को प्रभावित करता है, वायरल टिटर को समझने और वायरल जोड़ को नियंत्रित करने के महत्व पर जोर देता है।

6. एकीकरण: वायरल एकीकरण के जीनोम-व्यापी अध्ययनों से पता चला है कि लेंटिवायरस अक्सर ट्रांसक्रिप्शनल रूप से सक्रिय क्षेत्रों, हाल ही में ट्रांसलोकेशन घटनाओं में शामिल क्षेत्रों और अन्य 'कमजोर' जीनोमिक स्थानों में एकीकृत होते हैं, और यह प्राथमिकता लक्ष्य प्रजातियों में संरक्षित होती है। जबकि एकीकरण की ओर सामान्य प्रवृत्ति ज्ञात है, यह यादृच्छिक और भविष्यवाणी करना कठिन है।

 

अंत में:

मेजबान जीनोम में स्थिर रूप से एकीकृत होने और दीर्घकालिक ट्रांसजीन अभिव्यक्ति का समर्थन करने की उनकी क्षमता के कारण, लेंटिवायरल वैक्टर का व्यापक रूप से अनुसंधान और नैदानिक ​​​​सेटिंग्स दोनों में उपयोग किया जाता है। सामान्य अनुप्रयोगों में स्थिर सेल लाइन निर्माण, सीआरआईएसपीआर लाइब्रेरी डिलीवरी, पशु मॉडल विकास और जीन थेरेपी अनुसंधान शामिल हैं। लेंटीवायरल ट्रांसडक्शन सेल प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला में एक विश्वसनीय और बहुमुखी जीन वितरण दृष्टिकोण प्रदान करता है, जिसमें गैर-विभाजित कोशिकाएं भी शामिल हैं जो अक्सर अन्य ट्रांसडक्शन विधियों के लिए दुर्दम्य होती हैं। सावधानीपूर्वक प्रयोगात्मक डिजाइन और अनुकूलन ट्रांसडक्शन दक्षता और जीन अभिव्यक्ति की स्थिरता को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ा सकते हैं।

 

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परियोजना		वायरल ट्रांसडक्शन-लेंटीवायरस
सेल प्रयोज्यता		लगभग सभी कोशिका रेखाएँ
क्षमता		उच्च
यादृच्छिक एकीकरण		वाई
जैव सुरक्षा स्तर		बीएल2
जीन पारगमन क्षमता		<4-5k
चयन के बाद सकारात्मक दर		उच्च
समय रेखा	जीन संश्लेषण एवं प्लास्मिड निर्माण	4-5 सप्ताह
	वायरस पैकेज	1-2 सप्ताह
	पूल स्थिर सेल चयन	1-2 सप्ताह
	मोनोक्लोनल कोशिका	>3 सप्ताह
	कुल	>9-11 सप्ताह
कार्यभार		मध्यम