डीपीसीआर प्राइमर जांच

परिभाषा

डीपीसीआर (डिजिटल पीसीआर)

① यह तीसरी पीढ़ी की पीसीआर तकनीक है और पारंपरिक पीसीआर और क्यूपीसीआर (वास्तविक समय प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर) के बाद एक प्रमुख नवाचार है।

② एक पारंपरिक पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली समान रूप से हजारों या लाखों छोटी बूंदों या प्रतिक्रिया कुओं में वितरित की जाती है, प्रत्येक इकाई एक स्वतंत्र 'माइक्रोरिएक्टर' के रूप में कार्य करती है।

③मुख्य लाभ: इस 'फूट डालो और जीतो' रणनीति के माध्यम से, डीपीसीआर लक्ष्य अणुओं की संख्या को सीधे और पूरी तरह से निर्धारित कर सकता है (मानक वक्र की आवश्यकता के बिना) और इसमें अत्यधिक संवेदनशीलता है, जिससे न्यूक्लिक एसिड की बेहद कम मात्रा (जैसे दुर्लभ उत्परिवर्तन और रोगजनकों की ट्रेस मात्रा) का पता लगाने में सक्षम होता है।

प्राइमर जांच

यह क्यूपीसीआर तकनीक में आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला पता लगाने वाला तत्व है और डीपीसीआर में भी इसका व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इसे आमतौर पर टैकमैन जांच के रूप में जाना जाता है।

संघटन:

1.प्राइमर: छोटे, एकल-फंसे डीएनए टुकड़ों की एक जोड़ी जो विशेष रूप से लक्ष्य डीएनए अनुक्रम को पहचानती है और प्रवर्धन शुरू करती है।

2.जांच: एक और भी छोटा, लेबल वाला डीएनए अनुक्रम। इसे दोनों सिरों पर लेबल किया गया है:

*एक रिपोर्टर (उदाहरण के लिए, FAM): एक छोर पर एक फ्लोरोसेंट सिग्नल उत्सर्जित करता है।

*एक बुझाने वाला (बुझाने वाला): जब दोनों संपर्क में आते हैं तो रिपोर्टर के उत्सर्जन को दबा देता है।

*कार्य सिद्धांत: पीसीआर प्रवर्धन के दौरान, टाक एंजाइम जांच को ख़राब कर देता है क्योंकि यह डीएनए स्ट्रैंड का विस्तार करता है, रिपोर्टर और क्वेंचर समूहों को अलग करता है और एक फ्लोरोसेंट सिग्नल जारी करता है। प्रवर्धित प्रत्येक लक्ष्य अणु एक फ्लोरोसेंट संकेत उत्पन्न करता है।

सारांश:

डीपीसीआर प्राइमर जांच डिजिटल पीसीआर (डीपीसीआर) प्रयोगों के लिए डिज़ाइन किए गए प्राइमरों और जांचों का एक अत्यधिक विशिष्ट सेट है। उनका उद्देश्य डीपीसीआर तकनीक को एक नमूने में लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड (डीएनए या आरएनए) की बेहद कम मात्रा का सटीक और विशेष रूप से पता लगाने और बिल्कुल मात्रा निर्धारित करने में सक्षम बनाना है।

डीपीसीआर प्राइमर और जांच की भूमिका

डीपीसीआर प्रणाली में, प्राइमर जांच के मुख्य कार्यों में शामिल हैं:

* विशिष्ट पहचान: प्राइमर सटीक रूप से पता लगाए जा रहे लक्ष्य जीन अनुक्रम के सिरों से जुड़ते हैं, जिससे यह सुनिश्चित होता है कि केवल रुचि का न्यूक्लिक एसिड खंड (उदाहरण के लिए, उपन्यास कोरोनवायरस में एक जीन या कैंसर में उत्परिवर्तन स्थल) प्रवर्धित होता है।

*सिग्नल निर्माण और प्रवर्धन: जांच अदृश्य न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन प्रक्रिया को एक पता लगाने योग्य फ्लोरोसेंट सिग्नल में परिवर्तित करती है। प्रत्येक प्रवर्धित लक्ष्य अणु एक फ्लोरोसेंट संकेत उत्सर्जित करता है।

*पूर्ण परिमाणीकरण प्राप्त करना: यह डीपीसीआर की सबसे शक्तिशाली विशेषता है। प्रतिक्रिया पूरी होने के बाद, डिवाइस प्रत्येक बूंद/कुएं को स्कैन करता है। प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करने वाली इकाइयों को 'सकारात्मक' लेबल दिया जाता है, जबकि जो इकाइयां प्रतिदीप्ति उत्सर्जित नहीं करती हैं उन्हें 'नकारात्मक' लेबल दिया जाता है। सकारात्मक बूंदों के अनुपात की गणना करके और पॉइसन वितरण सांख्यिकीय मॉडल को लागू करके, मूल नमूने में लक्ष्य अणु की पूर्ण प्रतिलिपि संख्या (उदाहरण के लिए, प्रति मिलीलीटर प्रतियों की संख्या) की सीधे गणना की जा सकती है, जिससे मानक वक्र की आवश्यकता पूरी तरह से समाप्त हो जाती है।

रोग से संबंधित

डीपीसीआर प्राइमर-जांच तकनीक, अपनी अति-उच्च संवेदनशीलता के कारण, विभिन्न प्रकार की बीमारियों के अनुसंधान और निदान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, विशेष रूप से निम्नलिखित स्थितियों में::

1. कैंसर

①तरल बायोप्सी: रक्त में परिसंचारी ट्यूमर डीएनए (सीटीडीएनए) का पता लगाना। सीटीडीएनए आम तौर पर बहुत कम स्तर पर मौजूद होता है, और डीपीसीआर सीटीडीएनए में दुर्लभ उत्परिवर्तन (जैसे ईजीएफआर, केआरएएस और बीआरएफ उत्परिवर्तन) का सटीक पता लगा सकता है, जिससे प्रारंभिक कैंसर जांच, दवा मार्गदर्शन, प्रभावकारिता निगरानी और दवा प्रतिरोध का पता लगाना संभव हो जाता है।

②कैंसर जीनोमिक्स: जीन कॉपी संख्या भिन्नता (सीएनवी) और कम-बहुतायत संलयन जीन का अध्ययन।

2. संक्रामक रोग

① सटीक वायरल लोड मात्रा का ठहराव: उन परिदृश्यों के लिए विशेष रूप से उपयुक्त, जिनमें वायरल स्तरों की अत्यधिक उच्च-सटीक निगरानी की आवश्यकता होती है, जैसे एचआईवी, एचबीवी (हेपेटाइटिस बी वायरस), और एचसीवी (हेपेटाइटिस सी वायरस) के लिए चिकित्सीय प्रभावकारिता मूल्यांकन।

②दुर्लभ रोगज़नक़ का पता लगाना: उच्च पृष्ठभूमि न्यूक्लिक एसिड की उपस्थिति में रोगजनकों के बेहद निम्न स्तर का पता लगाना, जैसे कि प्रारंभिक चरण या अव्यक्त संक्रमण में।

3.आनुवंशिक रोग

① प्रसवपूर्व निदान: डाउन सिंड्रोम जैसे क्रोमोसोमल एयूप्लोइडीज़ की जांच के लिए मातृ परिधीय रक्त में सेल-मुक्त भ्रूण डीएनए (सीएफएफडीएनए) का विश्लेषण करके गैर-इनवेसिव प्रीनेटल परीक्षण (एनआईपीटी) किया जाता है। यह विधि पारंपरिक तरीकों की तुलना में अधिक सुरक्षित और सटीक है।

② मोनोजेनिक आनुवंशिक रोग: वाहक स्क्रीनिंग और रोग टाइपिंग के लिए एलील आवृत्ति में छोटे अंतर का पता लगाना।

4.अन्य क्षेत्र

अंग प्रत्यारोपण अस्वीकृति निगरानी: दाता-व्युत्पन्न कोशिका-मुक्त डीएनए (डीडी-सीएफडीएनए) का पता लगाने से प्रत्यारोपण अस्वीकृति की प्रारंभिक चेतावनी मिलती है।

अनुप्रयोग परिदृश्य

डीपीसीआर प्राइमर जांच में अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है, मुख्य रूप से वैज्ञानिक अनुसंधान और नैदानिक ​​​​निदान जैसे अत्याधुनिक क्षेत्रों में:

1.दुर्लभ लक्ष्य का पता लगाना

जब किसी नमूने में लक्ष्य अनुक्रम बेहद निम्न स्तर (<0.1%) पर मौजूद होता है, जिससे पारंपरिक क्यूपीसीआर का उपयोग करके पता लगाना मुश्किल हो जाता है, तो डीपीसीआर पसंद का उपकरण है। उदाहरण के लिए, कैंसर के उपचार (न्यूनतम अवशिष्ट रोग, एमआरडी) के बाद शेष कैंसर कोशिका डीएनए की ट्रेस मात्रा की निगरानी करना।

2. पूर्ण परिमाणीकरण की आवश्यकता वाले परिदृश्य

①संबंधित परिवर्तनों के बजाय सटीक प्रतिलिपि संख्या की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए:

②वायरल लोड मानक अंशांकन: क्यूपीसीआर प्रयोगों के लिए सटीक मानक वक्र और मानक विकसित करना।

③जीन अभिव्यक्ति अध्ययन: कम-व्यक्त जीन के प्रतिलेख स्तर को सटीक रूप से मापना।

④ अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) परिणाम सत्यापन: एनजीएस द्वारा पाए गए दुर्लभ उत्परिवर्तनों को मान्य करना और सटीक मात्रा निर्धारित करना।

3. जटिल पृष्ठभूमि में सटीक माप

जब नमूनों में कई समान अनुक्रम या अवरोधक होते हैं जो क्यूपीसीआर दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं, तो डीपीसीआर हस्तक्षेप को अधिक मजबूती प्रदान करता है, जिसके परिणामस्वरूप अधिक विश्वसनीय परिणाम मिलते हैं। उदाहरण के लिए, प्रचुर मात्रा में जंगली-प्रकार के जीनों की पृष्ठभूमि में कम-आवृत्ति उत्परिवर्तन का पता लगाना।

4. आणविक निदान उत्पादों का विकास

आईवीडी (इन विट्रो डायग्नोस्टिक) उत्पादों की मुख्य तकनीक के रूप में, इसका उपयोग अत्यधिक संवेदनशील प्रारंभिक कैंसर स्क्रीनिंग और संक्रामक रोग का पता लगाने वाली किट विकसित करने के लिए किया जाता है।