एएफ परीक्षण के नतीजे उम्मीद के मुताबिक नहीं आने के कई कारण हो सकते हैं।
आमतौर पर निम्नलिखित सामान्य कारण होते हैं:
1) तकनीकी मंच के पद्धतिगत पहलुओं में अंतर। सीओए द्वारा प्रस्तुत एएफ मान और त्रुटि सीमा डिजिटल पीसीआर की पूर्ण मात्रात्मक गणना के परिणामों पर आधारित है।
जब मानक का पता अन्य पद्धतियों (जैसे एनजीएस) द्वारा लगाया जाता है, तो एएफ का विचलन बढ़ सकता है। यह प्रवर्धन पता लगाए गए उत्परिवर्तन के प्रकार, लक्ष्य जीन की प्रतिलिपि संख्या और अनुक्रम विशिष्टता, नमूने के गुणसूत्र प्लोइडी, अपनाए गए विशिष्ट प्रयोगात्मक तकनीकी मार्ग और बाद में जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण विधि से संबंधित है। विशेष रूप से, 1) जब उत्परिवर्तन एसएनवी होता है, तो डिजिटल पीसीआर और एनजीएस द्वारा प्राप्त एएफ मूल्य में आम तौर पर एक छोटा विचलन होता है, जबकि सीएनवी और संलयन उत्परिवर्तन का एएफ मूल्य विचलन बड़ा होता है। प्रयोगात्मक दृष्टिकोण से, डिजिटल पीसीआर संपूर्ण जीडीएनए नमूने का प्रवर्धन और परिमाणीकरण है, जबकि नमूने को अक्सर एनजीएस पुस्तकालय निर्माण प्रक्रिया के दौरान कतरने की आवश्यकता होती है। कतरनी आम तौर पर सीएनवी के एएफ और संलयन उत्परिवर्तन के लिए कतरनी से पहले विचलन करना आसान बनाती है। कतरनी से पहले और बाद में सीएनवी और संलयन उत्परिवर्तन नमूनों का पता लगाने के लिए डिजिटल पीसीआर का उपयोग करते समय हम अक्सर इस घटना को देखते हैं। हमने असामान्य समग्र गुणसूत्र प्लोइडी वाले कुछ नमूनों में कतरनी के बाद भी यह अंतर पाया है। इसके अलावा, परीक्षण के बाद के जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के दृष्टिकोण से, एसएनवी एएफ मूल्यों की गणना और विश्लेषण विधियां अपेक्षाकृत परिपक्व और एकीकृत हैं, और डिजिटल पीसीआर एएफ मूल्यों की गणना सिद्धांतों के करीब हैं। इसलिए, एनजीएस और डिजिटल पीसीआर परिणामों के बीच अंतर अक्सर छोटा होता है। हालाँकि, CNV और फ़्यूज़न म्यूटेशन की AF गणना जैव सूचना विज्ञान एल्गोरिदम पर अधिक निर्भर है। योजनाएं कम एकीकृत और परिपक्व हैं, और एल्गोरिदम एक कंपनी से दूसरी कंपनी में बहुत भिन्न होते हैं। यह इसके और डिजिटल पीसीआर कैलिब्रेशन एएफ के बीच बड़े अंतर का एक कारण है।
इसके अलावा, पद्धतिगत दृष्टिकोण से, डिजिटल पीसीआर पूर्ण परिमाणीकरण के लिए एक सरल, एकल-शॉट पीसीआर विधि है। एनजीएस विधियां, चाहे एम्प्लिकॉन या कैप्चर योजनाओं का उपयोग कर रही हों, लाइब्रेरी निर्माण और अनुक्रमण के दौरान एकाधिक या मल्टीप्लेक्स पीसीआर शामिल हो सकती हैं। यह पीसीआर प्रक्रिया कुछ पक्षपातपूर्ण प्रवर्धन उत्पन्न कर सकती है, जिससे एएफ मूल्यों में विचलन हो सकता है। हमने डिजिटल पीसीआर प्रयोगों के माध्यम से यह भी सत्यापित किया है कि पीसीआर उत्पादों के लिए एएफ मान कुछ नमूनों और लोकी के लिए पुस्तकालय निर्माण से पहले और बाद के बीच भिन्न होते हैं। इसके अलावा, अपर्याप्त या असमान एनजीएस अनुक्रमण गहराई के कारण एएफ मान अपेक्षाओं से भिन्न हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, उच्च या निम्न जीसी सामग्री वाली साइटों पर, अनुक्रमण गहराई अन्य क्षेत्रों की तुलना में असमान हो सकती है, जिससे एएफ विचलन हो सकता है। इसके अलावा, उच्च प्रतिलिपि संख्या प्रवर्धन वाली साइटों पर, स्थानीयकृत अपर्याप्त अनुक्रमण गहराई के परिणामस्वरूप पता लगाने की ऊपरी सीमा वास्तविक प्रतिलिपि संख्या से कम हो सकती है, जिससे वास्तविक प्रतिलिपि संख्या को प्रतिबिंबित करने के लिए उच्च अनुक्रमण गहराई की आवश्यकता होती है।
ये एएफ विचलन के कुछ सामान्य कारण हैं। कुल मिलाकर, एएफ विसंगतियों के कारण बहुआयामी और जटिल हैं, प्रत्येक मामले के विशिष्ट विश्लेषण की आवश्यकता होती है। वास्तविक मामलों का सामना करते समय, हमें विश्लेषण की सुविधा के लिए ग्राहक के मूल डेटा और प्रयोगात्मक विवरण की आवश्यकता हो सकती है।
