Puede haber muchas razones por las que los resultados de la prueba de FA no sean los esperados.
Suelen existir las siguientes razones comunes:
1) Diferencias en los aspectos metodológicos de la plataforma técnica. El valor de AF y el rango de error presentado por COA se basan en los resultados del cálculo cuantitativo absoluto de la PCR digital.
Cuando el estándar se detecta mediante otras metodologías (como NGS), la desviación de AF puede amplificarse. Esta amplificación está relacionada con el tipo de mutación detectada, el número de copias y la especificidad de secuencia del gen diana, la ploidía cromosómica de la muestra, la ruta técnica experimental específica adoptada y el método de análisis bioinformático posterior. Específicamente, 1) Cuando la mutación es SNV, el valor de AF obtenido mediante PCR digital y NGS generalmente tiene una pequeña desviación, mientras que la desviación del valor de AF de CNV y mutaciones de fusión es grande. Desde una perspectiva experimental, la PCR digital es una amplificación y cuantificación de la muestra completa de ADNg, mientras que a menudo es necesario cortar la muestra durante el proceso de construcción de la biblioteca NGS. El corte generalmente facilita que la FA de CNV y las mutaciones de fusión se desvíen de la anterior al corte. A menudo observamos este fenómeno cuando utilizamos la PCR digital para detectar CNV y muestras de mutaciones de fusión antes y después del corte. También hemos encontrado esta diferencia después del corte en algunas muestras con ploidía cromosómica general anormal. Además, desde la perspectiva del análisis bioinformático posterior a la prueba, SNV Los métodos de cálculo y análisis de los valores de AF son relativamente maduros y unificados, y están más cerca de los principios de cálculo de los valores de AF de PCR digital. Por lo tanto, las diferencias entre los resultados de NGS y PCR digital suelen ser pequeñas. Sin embargo, el cálculo de FA de CNV y mutaciones de fusión depende más de algoritmos bioinformáticos. Los esquemas están menos unificados y maduros, y los algoritmos varían mucho de una empresa a otra. Esta es una de las razones de la gran diferencia entre este y el AF de calibración digital por PCR.
Además, desde una perspectiva metodológica, la PCR digital es un método de PCR simple y de un solo disparo para la cuantificación absoluta. Los métodos NGS, ya sea que utilicen esquemas de amplicones o de captura, pueden implicar una PCR múltiple o múltiple durante la construcción y secuenciación de la biblioteca. Este proceso de PCR puede producir cierta amplificación sesgada, lo que provoca desviaciones en los valores de AF. También hemos verificado mediante experimentos de PCR digital que los valores de AF para los productos de PCR varían entre la construcción previa y posterior a la biblioteca para ciertas muestras y loci. Además, una profundidad de secuenciación NGS insuficiente o desigual también puede hacer que los valores de AF difieran de lo esperado. Por ejemplo, en sitios con contenido de GC alto o bajo, la profundidad de secuenciación puede ser desigual en comparación con otras regiones, lo que genera desviaciones de AF. Además, en sitios con una amplificación del número de copias alto, una profundidad de secuenciación insuficiente localizada puede dar como resultado que el límite superior de detección sea menor que el número de copias verdadero, lo que requiere una profundidad de secuenciación mayor para reflejar el número de copias verdadero.
Estas son sólo algunas de las causas comunes de desviación de la FA. En general, las causas de las discrepancias en la FA son multifacéticas y complejas, y requieren un análisis específico de cada caso. Cuando nos encontramos con casos reales, es posible que necesitemos los datos originales del cliente y detalles experimentales para facilitar el análisis.
