Líneas celulares estables integradas en transposones

Los elementos transponibles (TE), también conocidos como genes saltarines, son secuencias de ADN capaces de moverse de una ubicación genómica a otra. Descubiertos por primera vez por Barbara McClintock, los TE se reconocen ahora como componentes ubicuos de los genomas tanto de procariotas como de eucariotas. En muchos organismos, constituyen una proporción sustancial del genoma; por ejemplo, aproximadamente el 50% del genoma humano y hasta el 90% del genoma del maíz.

Los elementos transponibles se pueden dividir en dos categorías según su mecanismo de transposición:
1. Elementos transponibles de clase I (también conocidos como retrotransposones)
2. Elementos transponibles de clase II (también conocidos como transposones de ADN).

Los transposones de clase I, también conocidos como retrotransposones, se transponen mediante un mecanismo de 'copiar y pegar Ctrl C+V' (Figura 1). Primero se replican a sí mismos como transcripciones de ARN, que luego se transcriben inversamente en ADN mediante una enzima llamada transcriptasa inversa, y finalmente se insertan en un nuevo sitio objetivo. Esto es similar al mecanismo de replicación de retrovirus como el VIH.

Los transposones de clase II también se denominan transposones de ADN porque no requieren mediación de ARN para su movimiento. La mayoría de los transposones de clase II emplean un mecanismo de transposición no replicativo de 'cortar y pegar Ctrl X+V': se escinden de un lugar y luego se insertan en otro (Figura 2). Los transposones de clase II tienen repeticiones terminales largas (LTR) en ambos extremos.

Aunque existen muchos tipos diferentes de transposones, los transposones de ADN se utilizan con mayor frecuencia para la manipulación del genoma en el laboratorio. Cuando se utilizan transposones en el laboratorio, el gen de la transposasa se proporciona en trans para insertar el gen objetivo entre las repeticiones terminales largas (LTR) del transposón, similar al proceso de empaquetado utilizado en los vectores virales.

Tres sistemas de transposones comunes adecuados para su uso como herramientas de investigación son Sleeping Beauty, PiggyBac y Tol2.

Los transposones son inherentemente mutagénicos, lo que los convierte en excelentes herramientas para las pruebas de mutagénesis para detectar mutaciones de pérdida o ganancia de función. En estas pantallas, los transposones codifican genes indicadores, casetes mutagénicos o códigos de barras. Cuando se entregan a células u organismos modelo, se integran en el genoma del huésped. Luego se utiliza la secuenciación de próxima generación para detectar sitios de inserción de transposones y se realiza un análisis para determinar qué inserciones se seleccionaron positiva o negativamente durante el experimento.

Los animales transgénicos generalmente se generan inyectando ADN directamente en el pronúcleo de óvulos fertilizados, lo que resulta en una integración aleatoria de la secuencia en el genoma, un proceso altamente impredecible. Sin embargo, los transposones pueden integrarse eficientemente en el genoma de los óvulos fertilizados después de su inyección en el citoplasma, un proceso que es mucho menos eficiente cuando el ADN se inyecta directamente. La Bella Durmiente, piggyBac y Tol2 se han utilizado para generar animales transgénicos, incluidos peces cebra, ratones, ratas y conejos.

Los transposones son una alternativa a los vectores lentivirales para la construcción de líneas celulares estables, como la reprogramación de iPSC y la terapia genética y celular, y tienen el potencial de superar algunas de las limitaciones de los virus. Los transposones (TE) tienen grandes cargas útiles, que alcanzan hasta 100 kB utilizando La Bella Durmiente y piggyBac, lo que ofrece una ventaja significativa sobre los vectores virales (las cargas útiles de AAV son de aproximadamente 5 kB, mientras que las cargas útiles lentivirales son de aproximadamente 8 kB). También es menos probable que los transposones induzcan una respuesta inmune que los vectores virales y son más fáciles y baratos de producir. Ambos métodos de administración pueden potencialmente causar alteración genética debido a la integración, pero debido a que los TE se insertan principalmente en regiones intergénicas, la alteración genética es una preocupación menor.

Los sgRNA se pueden utilizar para guiar la transposición en una ubicación específica. Se ha informado que el sistema INTEGRATE (guía de inserción dirigida de elementos transponibles asistida por ARN) logra aproximadamente el 100% de integración de fragmentos de ADN de hasta 10 kB en bacterias.