La transfección de plásmidos comunes carece de un mecanismo de integración específico de sitio específico. Por lo tanto, cuando el plásmido se introduce en el núcleo celular, la integración se produce de forma aleatoria y sólo una pequeña porción del plásmido se repara mediante roturas del ADN durante la replicación celular y se integra en el genoma cromosómico del huésped.
Así, resumimos varias características clave:
1. La integración aleatoria conduce a una baja eficiencia de integración y la integración en regiones transcripcionales activas no siempre es posible;
2. Una gran cantidad de plásmido no integrado (por ejemplo, usando transfección 1x10e6 de 5 μg, para un vector pcDNA3.1 más un gen diana de 3000 pb,
aproximadamente 5,37*10e11 (el número de copias se diluye o degrada gradualmente a medida que las células se dividen).
3. Normalmente se produce un pico de expresión transitoria entre 24 y 96 horas.
4. Los ejemplares integrados deben someterse a un cribado antibiótico para obtener células positivas, debiendo mantenerse la resistencia posteriormente.
5. Debido a que la integración se produce mediante la reparación y recombinación de roturas del ADN, existe la posibilidad de que se produzcan más roturas en el mismo sitio más adelante.
potencialmente alterando el gen objetivo. Por tanto, la estabilidad es un desafío. Se recomienda establecer una línea celular monoclonal estable y analizar su estabilidad durante el paso.
6. El ADN lineal se integra más eficientemente que el ADN circular, pero es más difícil de distribuir que el ADN circular.
7. Los diferentes tipos de células varían significativamente y se manifiestan tanto en la entrega como en la integración.
8. Los productos químicos que se entregan son algo tóxicos y se debe lograr un equilibrio entre la eficiencia de la entrega y la toxicidad.
9. El plásmido entregado debe estar libre de endotoxinas, ya que las endotoxinas pueden desencadenar una respuesta inmune.
