PCR-CE significa Reacción en Cadena de la Polimerasa - Electroforesis Capilar. Es una técnica híbrida de biología molecular que combina las capacidades de amplificación de alta eficiencia de la PCR con las capacidades de separación y detección de alta resolución de la CE. La PCR se utiliza para amplificar específicamente fragmentos de ADN diana. Luego, los productos amplificados se separan y se detectan mediante electroforesis capilar, lo que permite un análisis cualitativo, cuantitativo o de longitud de los amplicones.
Principio de funcionamiento
Preparación de muestras y amplificación por PCR : el ADN se extrae de la muestra y la amplificación por PCR se realiza utilizando cebadores diseñados para el objetivo específico. Los marcadores fluorescentes a menudo se introducen directamente durante el proceso de amplificación (por ejemplo, utilizando cebadores marcados con fluorescencia).
Inyección de electroforesis capilar : los productos de PCR se inyectan en un extremo de un tubo capilar.
Separación electroforética : bajo un campo eléctrico de alto voltaje, los fragmentos de ADN migran a través de un polímero tamiz dentro del tubo capilar, separándolos físicamente según el peso molecular.
Detección de fluorescencia y análisis de datos : a medida que fragmentos de ADN de diferentes tamaños pasan a través de la ventana de detección al final del tubo capilar, la luz láser excita el tinte fluorescente adjunto, generando una señal. El software registra la señal y genera un perfil de electroforesis, donde el eje horizontal representa el tiempo (que se puede convertir en tamaño de fragmento) y el eje vertical representa la intensidad de la fluorescencia. Al analizar la posición y la altura (o área) de los picos, se puede determinar el tamaño y la abundancia relativa de los fragmentos objetivo.
Principales aplicaciones de PCR-CE
Análisis MSI o STR :
Identificación forense : las huellas dactilares de ADN son el estándar de oro para las pruebas de paternidad y el desarrollo de bases de datos criminales.
Diagnóstico de tumores : la detección de inestabilidad de microsatélites (MSI) se utiliza para la detección del síndrome de Lynch y la predicción de la eficacia de la inmunoterapia.
Genotipado :
Análisis de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) : Los cebadores están diseñados para amplificar fragmentos que contienen el sitio SNP, y su especificidad de longitud se puede utilizar para el genotipado.
Análisis de polimorfismo Indel : el genotipado se realiza directamente en función de las diferencias en la longitud del producto de PCR.
Detección de mutaciones : se utiliza para detectar mutaciones de inserción/eliminación conocidas.
Análisis de expresión genética (cuantificación relativa) : el ADNc se amplifica mediante transcripción-PCR inversa (RT-PCR), se separa por CE, y la cuantificación relativa se realiza comparando la altura o el área del pico del producto amplificado de un gen específico en diferentes muestras.
Análisis de carga viral : la cuantificación relativa del ADN viral se realiza mediante PCR competitiva o calibración de control interno.
Ventajas
Resolución alta
Puede distinguir fragmentos de ADN que difieren en sólo 1 a 4 pb de longitud, con mucha mayor precisión que la electroforesis en gel de agarosa.
Automatización de alto rendimiento
La carga automatizada de muestras en placas de 96 o 384 pocillos permite el análisis continuo y sin supervisión de una gran cantidad de muestras, lo que resulta en una eficiencia extremadamente alta.
Alta sensibilidad
La detección de fluorescencia inducida por láser (LIFD) ofrece una sensibilidad excepcional y requiere una carga mínima de muestra (niveles nanolíticos).
Resultados digitales
Los resultados se generan como electroferogramas, lo que proporciona datos precisos, facilidad de análisis de software y archivo, con alta objetividad.
No se requiere preparación de gel
Esto evita el riesgo de exposición a carcinógenos como el bromuro de etidio (EB) durante la electroforesis en gel de agarosa.
Limitaciones
Cuantificación relativa
Normalmente, sólo es posible la cuantificación relativa (p. ej., comparación entre muestras), no la cuantificación absoluta como la qPCR.
Alto costo
El coste de la instrumentación y los consumibles (capilares, gel tamizador) es mayor que el de la electroforesis en gel convencional.
Falta de monitoreo en tiempo real
A diferencia de la qPCR, la PCR-CE es un ensayo de criterio de valoración y solo se puede analizar una vez completada la PCR, lo que impide la observación en tiempo real del proceso de amplificación.
Limitación del tamaño de los fragmentos
La separación óptima normalmente ocurre entre decenas y cientos de pares de bases, y la eficiencia de la separación puede reducirse para fragmentos muy grandes (>1000 pares de bases).
Información limitada
Principalmente proporciona información sobre la longitud de los fragmentos y no puede detectar directamente cambios específicos en la secuencia misma (como mutaciones puntuales que no alteran la longitud), lo que requiere integración con otras técnicas (como la secuenciación).
Conclusión
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En resumen, PCR-CE es una poderosa tecnología de análisis de puntos finales. Su valor principal radica en el análisis del tamaño de fragmentos de alta resolución y alto rendimiento de productos de amplificación por PCR.
Es como utilizar por primera vez la PCR, como 'tijeras de precisión', para cortar fragmentos específicos del vasto modelo de ADN.
Luego, utilizando CE, como un 'tamiz superpreciso', se miden con precisión las longitudes de estos fragmentos.
Aunque es inferior a qPCR en cuantificación absoluta y monitoreo en tiempo real, e inferior a la secuenciación en la interpretación de información de secuencia detallada, sigue siendo una plataforma tecnológica central indispensable para aplicaciones basadas en diferencias de longitud de fragmentos (como STR, MSI e InDel tipificación) debido a su automatización, alta precisión y alto rendimiento.
