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Estándares del sitio de integración lentiviral
Fondo
La inmunoterapia de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR-T) es un método de tratamiento personalizado que utiliza tecnología de modificación genética para preparar linfocitos T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR), que se expanden in vitro y luego se infunden nuevamente en el cuerpo del paciente.
En los últimos años, con el lanzamiento de productos de terapia celular como Kymriah, Yescarta y Strimvelis, el lentivirus es un vector intermedio clave en el proceso de carga celular CAR. Garantizar la calidad y seguridad de los medicamentos basados en lentivirus es un enorme desafío. A finales del año pasado, la FDA anunció una investigación sobre los problemas de seguridad de la terapia CAR-T; se cree que la aparición de riesgos de cáncer de células T se debe al vector de administración de genes utilizado: el vector lentiviral. El 31 de enero de este año, se publicó oficialmente la guía 'Consideraciones para el desarrollo de productos de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR)'. Se recomienda determinar el estándar de liberación del número de copias del vector (VCN) en función de la evaluación de riesgos. La evaluación de riesgos incluye datos experimentales respaldados por investigaciones como análisis del sitio de inserción, ventaja clonal, dosis, indicación y población de estudio.
Las 'Directrices técnicas y de investigación no clínica para productos de terapia celular genéticamente modificados' emitidas por el Centro de Aprobación de Medicamentos de la Administración Nacional de Productos Médicos (CDE) también incluyen la 'evaluación del riesgo de mutación por inserción' como parte de la investigación de seguridad no clínica y especifican en detalle los puntos de evaluación de los factores de riesgo clave. Por lo tanto, la terapia CAR-T debe evaluar los riesgos potenciales de mutaciones de inserción y carcinogenicidad.
Introducción
En 2021, China emitió cuatro directrices consecutivas para productos relacionados con la terapia génica, y todas señalaron que la detección de integración lentiviral debe incluir al menos 1. Dirección de integración 2. Posición de integración 3. Número absoluto de clones en una posición de integración específica y en una dirección de integración.。
En respuesta a este requisito, CB-Gene lanza ahora estándares de sitios de integración lentivirales.
El sitio de inserción lentiviral se determinó en función de los resultados de NGS (secuenciación de sonda de captura) y se volvió a verificar mediante secuenciación Sanger y ddPCR para localizar con precisión el sitio de inserción lentiviral y la frecuencia de integración.
Servicio de detección de sitios de integración lentiviral
CB-Gene ofrece ahora un servicio de detección de sitios de integración lentivirales (tecnología de secuenciación de sondas de captura). La tecnología de secuenciación de sondas de captura realiza principalmente la captura de sondas en la región LTR y, después de la PCR, se realiza la verificación de secuenciación NGS y, en combinación con métodos de análisis bioinformáticos, se determina el sitio de inserción lentiviral. Posteriormente se utilizaron los métodos de Sanger y ddPCR para verificar la tecnología NGS (capture probe sequencing). Los sitios detectados por NGS (secuenciación de sonda de captura) se detectaron mediante los métodos Sanger y ddPCR.
| Nombre | Descripción |
| Tecnología de secuenciación de sondas de captura. | Análisis de sitios de integración lentivirales. |
El servicio de detección del sitio de inserción de lentivirus (secuenciación de sonda de captura) puede ayudarlo a localizar con precisión el sitio de inserción de lentivirus. El estándar del sitio de integración de lentivirus no solo se puede aplicar a una variedad de métodos de detección para ayudarlo a determinar la precisión del método, sino que también se puede usar para ubicar el límite de detección del método de detección.
Características de la integración de lentivirus.
El lentivirus es actualmente el método de transducción principal para CAR-T (aproximadamente el 90% de los productos CAR-T aprobados por la FDA utilizan LV). La integración de lentivirus en las células es semialeatoria (prefiriendo regiones transcripcionalmente activas).
1.El lentivirus reconoce los receptores de la superficie del huésped y transporta ARN y proteínas al interior de las células;
2. El ARN viral se transcribe de forma inversa para formar ADNc lineal bicatenario (incluidas secuencias LTR en ambos extremos)
3.Integrase reconoce LTR y el ADNc se integra en el genoma del huésped;
4. Los genes exógenos continúan expresándose a medida que las células huésped se dividen.
Aplicación de lentivirus en la terapia con células CAR-T
El lentivirus es muy utilizado en terapia celular por sus características:
1. amplio rango de infección, alta eficiencia, infección efectiva de células en división y no en división;
2.fuerte estabilidad, integración en el genoma, expresión estable a largo plazo de genes exógenos;
3.baja inmunogenicidad y seguridad relativamente alta.
