Il peut y avoir de nombreuses raisons pour lesquelles les résultats du test AF ne correspondent pas à ceux attendus.
Il existe généralement les raisons courantes suivantes :
1) Différences dans les aspects méthodologiques de la plateforme technique. La valeur AF et la plage d'erreur présentées par COA sont basées sur les résultats du calcul quantitatif absolu de la PCR numérique.
Lorsque la norme est détectée par d'autres méthodologies (telles que NGS), l'écart de AF peut être amplifié. Cette amplification est liée au type de mutation détectée, au nombre de copies et à la spécificité de séquence du gène cible, à la ploïdie chromosomique de l'échantillon, à la voie technique expérimentale spécifique adoptée et à la méthode d'analyse bioinformatique ultérieure. Plus précisément, 1) Lorsque la mutation est SNV, la valeur AF obtenue par PCR numérique et NGS présente généralement un petit écart, tandis que l'écart de valeur AF des mutations CNV et de fusion est important. D'un point de vue expérimental, la PCR numérique est une amplification et une quantification de l'échantillon complet d'ADNg, alors que l'échantillon doit souvent être cisaillé pendant le processus de construction de la bibliothèque NGS. Le cisaillement permet généralement à l’AF du CNV et aux mutations de fusion de s’écarter de celui avant le cisaillement. Nous observons souvent ce phénomène lors de l’utilisation de la PCR numérique pour détecter des échantillons de CNV et de mutations de fusion avant et après le cisaillement. Nous avons également constaté cette différence après le cisaillement dans certains échantillons présentant une ploïdie chromosomique globale anormale. De plus, du point de vue de l'analyse bioinformatique post-test, SNV Les méthodes de calcul et d'analyse des valeurs AF sont relativement matures et unifiées, et sont plus proches des principes de calcul des valeurs PCR numériques AF. Par conséquent, les différences entre les résultats NGS et PCR numériques sont souvent minimes. Cependant, le calcul AF des mutations CNV et de fusion dépend davantage des algorithmes bioinformatiques. Les dispositifs sont moins unifiés et moins matures, et les algorithmes varient considérablement d'une entreprise à l'autre. C'est l'une des raisons de la grande différence entre celui-ci et l'AF d'étalonnage PCR numérique.
De plus, d’un point de vue méthodologique, la PCR numérique est une méthode simple de PCR en un seul coup pour une quantification absolue. Les méthodes NGS, qu'elles utilisent des schémas d'amplicon ou de capture, peuvent impliquer une PCR multiple ou multiplex lors de la construction et du séquençage de la bibliothèque. Ce processus PCR peut produire une amplification biaisée, entraînant des écarts dans les valeurs AF. Nous avons également vérifié grâce à des expériences de PCR numérique que les valeurs AF pour les produits PCR varient entre la construction pré et post-bibliothèque pour certains échantillons et locus. De plus, une profondeur de séquençage NGS insuffisante ou inégale peut également entraîner des valeurs AF différentes des attentes. Par exemple, sur les sites à contenu élevé ou faible en GC, la profondeur de séquençage peut être inégale par rapport à d’autres régions, entraînant des écarts AF. De plus, sur les sites présentant une amplification du nombre de copies élevée, une profondeur de séquençage insuffisante localisée peut avoir pour conséquence que la limite supérieure de détection soit inférieure au nombre réel de copies, ce qui nécessite une profondeur de séquençage plus élevée pour refléter le nombre réel de copies.
Ce ne sont là que quelques causes courantes de déviation de la FA. Dans l’ensemble, les causes des écarts AF sont multiples et complexes, nécessitant une analyse spécifique de chaque cas. Lorsque nous rencontrons des cas réels, nous pouvons exiger les données originales du client et les détails expérimentaux pour faciliter l'analyse.
