Vous êtes ici : Maison » Services » Développement du PCR » dPCR

Service de test dPCR

Principe de service

Droplet Digital PCR (ddPCR) est une méthode de PCR numérique développée par Bio-Rad qui utilise un système de gouttelettes d'émulsion eau-huile. Dans ce système, l’échantillon est divisé en milliers de gouttelettes de la taille d’un nanolitre, chacune servant de chambre de réaction individuelle, semblable à un tube à essai ou à un puits dans une plaque PCR mais à une échelle beaucoup plus petite. Ce partitionnement étendu des échantillons est une caractéristique clé de la ddPCR, permettant une quantification précise et absolue des molécules d’ADN cibles.

À partir des principes de base, il n’est pas difficile de voir que le plus grand avantage de la DdPCR est la quantification absolue, qui s’exprime comme suit :

Quantification absolue

La ddPCR fournit des décomptes absolus d’ADN cible par échantillon sans avoir besoin d’une courbe standard, ce qui en fait une technologie idéale pour mesurer l’ADN cible, analyser les charges virales et quantifier les populations microbiennes.

Haute précision

Le grand nombre d’affectations d’échantillons fourni par ddPCR peut mesurer de manière fiable de petites différences dans le nombre de copies de la séquence d’ADN cible dans l’échantillon.

Rapport signal/bruit amélioré

Les matrices à nombre élevé de copies et l'ADN de fond sont dilués, augmentant ainsi la concentration de molécules matrices dans les partitions cibles positives. Cela permet une détection sensible de cibles rares avec une précision quantitative de ± 10 %, une sensibilité jusqu'à une seule molécule d'acide nucléique et une limite de détection aussi basse que 0,001 %.

Éliminer le biais de la PCR

Éliminez la dépendance à l’efficacité de l’amplification qPCR, réduisez le taux d’erreur et détectez de petites différences (1,2 fois), il convient de le souligner ici.

Coûts de consommables réduits

Les volumes de réaction compris entre le picolitre et le nanolitre réduisent l'utilisation de réactifs et le volume d'échantillon par point de données, en particulier pour les échantillons précieux.

Excellent cloisonnement

La ddPCR génère environ 20 000 gouttelettes par échantillon de 20 µl, permettant près de 2 millions de réactions PCR partitionnées sur une plaque de 96 puits. Un partitionnement plus important améliore directement la précision de la quantification.

Demande de service

Combiné avec le domaine des tumeurs, nous avons généralement 4 applications qui s'y rapportent :

Détection de l'expression des gènes, principalement analyse quantitative de la détection des ARNm.

Détecter la mutation (SNV et Indel), peut détecter le numéro de copie et peut également détecter le rapport.

Détecter la fusion, peut détecter le numéro de copie et peut également détecter le rapport.

Détection de CNV (analyse de variation du nombre de copies), quantification relative.

Présentation du cas

CB-Gene développe des kits de détection correspondants pour les applications ci-dessus et utilise les produits de référence de CB-Gene pour évaluer les performances des kits. Prenons l'exemple de l'EGFR T790M :

Expérience 1 : test de limite à blanc LOB

Echantillons à tester : 20 échantillons négatifs et 1 NTC. La quantité d'entrée a été fixée à 10 ng et 40 ng respectivement, et chaque échantillon a été testé par PCR numérique Bio-Rad en double.

Échantillon 10ng	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	CTN
n=1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1.2	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
n=2	0	0	0	0	0	0	0	0.6	0	0	0	0	0	0.8	0	0	0	0	0	0	0

Échantillon 40ng	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	CTN
n=1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1.3	0	0	0	0	0	0	0	0.9	0	0	0
n=2	0	0	0	0.7	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

À partir des données ci-dessus, on peut voir que, qu'il s'agisse de 10 ng ou de 40 ng, le LOB est contrôlé dans les 2 copies (généralement les copies de bruit sont dans les 5), et le bruit ne montre pas de dépendance à la dose et est un signal de bruit généré aléatoirement.

Expérience 2 : Test de précision

Échantillons à tester : 10 échantillons vérifiés comme positifs par NGS (numérotés de 1 à 10) ; 10 échantillons vérifiés négatifs par NGS (numérotés 11-20). La PCR numérique a été utilisée pour tester les 20 échantillons.

Échantillon	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Valeur	72,21%	66,63%	13,25%	5,29%	10,34%	43,01%	22,19%	3,27%	1,07%	13,29%
Résultats	Positif	Positif	Positif	Positif	Positif	Positif	Positif	Positif	Positif	Positif

Échantillon	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
Valeur	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%
Résultats	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif	Négatif

À partir des données ci-dessus, nous pouvons voir que :
① Testez 10 échantillons positifs au NGS, les résultats des tests sont tous positifs, le taux de conformité positive est de 100 % et la fréquence de variation est détectée quantitativement.
② Testez 10 échantillons négatifs NGS, les résultats des tests sont tous négatifs, le taux de conformité négative est de 100 % et la fréquence de variation fixe est de 0 %.

Expérience 3 : Test de plage linéaire

1. Test linéaire entre la quantité d'entrée, le nombre et la fréquence de copies.
Tout d'abord, sélectionnez la norme EGFR T790M (CBP10402) avec une fréquence de mutation de 50 %. Ce standard est un gène à deux allèles avec CN = 2 édité par édition génétique. L’un est la mutation et l’autre est le WT. Après calcul de la valeur théorique, séquençage Sanger et kit Bio-Rad DdPCR (ID du test : dHsaCP2000019), il est confirmé qu'il s'agit d'une fréquence de 50 %.
1.1 Définissez 10 gradients entre 0,1 ng et 200 ng de quantité d'entrée et effectuez une détection PCR numérique (2 répétitions) pour déterminer si le numéro de copie FAM est linéairement lié à la quantité d'entrée et si le numéro de copie VIC est linéairement lié à la quantité d'entrée ;
1.2 Définissez 10 gradients entre 0,1 ng et 200 ng de quantité d'entrée et effectuez une détection PCR numérique (2 répétitions) pour déterminer si la fluctuation de %AF = 50 ± 10 % est satisfaite.

Entrée ng	200	100	50	20	10	5	2	1	0.5	0.1
Copies FAM (n=1)	18970	14970	7238	3327	1570	786	288	139	87	23
Copies FAM (n=2)	18367	15013	7139	3122	1430	722	290	151	67	21
Copies de la CIE (n=1)	20183	15180	7312	3290	1540	739	267	150	93	31
Copies de la CIE (n=2)	19783	14962	7016	3017	1510	697	281	143	80	30

Entrée ng	200	100	50	20	10	5	2	1	0.5	0.1
AF%(n=1)	48.45	49.65	49.75	50.28	50.48	51.54	51.89	48.10	48.33	42.59
AF%(n=2)	48.14	50.09	50.43	50.86	48.64	50.88	50.79	51.36	45.58	41.18

D'après les données ci-dessus, nous pouvons voir que : ①
L'entrée de 200 ng est trop grande, le nombre de copies n'est pas linéaire, bien qu'il atteigne la plage de 45 à 55 %, il ne convient pas à la détermination du nombre de copies à canal unique ;
②L'entrée de 0,1 ng est trop petite, le nombre de copies n'est pas linéaire et 42,59 % est également inférieur à 45 %, ce qui ne convient pas pour un canal unique ou double canal ;
Par conséquent : la plage est de 0,5 à 100 ng

2. Test linéaire des valeurs théoriques et des valeurs de détection à différentes fréquences de dilution linéaire
Sur la base des conclusions ci-dessus, nous avons sélectionné 10 ng comme exploration plus approfondie de la plage linéaire %AF. Tout d'abord, nous avons utilisé l'étalon négatif correspondant d'EGFR T790M, effectué une dilution limite sur 50 % de l'étalon, défini 9 gradients AF entre 0,1 % et 50 % et effectué une détection PCR numérique (2 répétitions).

%AF attendu	50 ± 10 %	25 ± 10 %	10 ± 10 %	5 ± 20 %	3 ± 20 %	1 ± 30 %	0,5 ± 30 %	0,2 ± 30 %	0,1 ± 50 %
%AF(n=1)	49.14	24.82	9.82	4.52	2.94	0.95	0.55	0.16	0.13
%AF(n=2)	50.25	26.20	10.24	4.98	2.55	0.79	0.59	0.19	0.13

À partir des données ci-dessus, nous pouvons voir qu’avec une entrée de 10 ng, AF% présente une très bonne dilution linéaire, avec quelques fluctuations, mais le tout dans la plage d’erreur.

Expérience 4 : Test de limite de détection

Nous pouvons prédire la plage limite de détection possible grâce à un calcul théorique. Lorsque la copie de contrôle est inférieure à 15 000 (correspondant à une entrée de 50 ng), les données LOB sont de 2, 2/15 000 = 0,0133 % et la limite de détection prévue est de 0,0200 %.
À une fréquence aussi basse, le scénario d’application clinique convient à l’ADNc. D'une manière générale, dans la pratique clinique, la valeur médiane de l'ADNc de 10 ml de sang total est de 20 à 40 ng et la valeur la plus basse est de 20 ng. La valeur théorique de 20 ng est de 6 000 copies, 2/6 000 = 0,0333 %, et la limite de détection prévue est de 0,0500 %.
La plage d'erreur de 0,05 % est de ±50 %, soit 0,025 à 0,075 %, nous choisissons donc 3 points et explorons des LOD de 0,010 %, 0,050 % et 0,100 %, respectivement, nécessitant une détection de 95 %.

0,010 %
Effectuez un test PCR numérique sur 20 échantillons avec 0,01 % pour voir si une détection de 95 % est obtenue entre 0,005 et 0,015 %

Des tests PCR numériques à 0,05 %
ont été effectués sur 20 échantillons à 0,05 % pour observer si une détection de 95 % était obtenue dans une plage de 0,025 à 0,075 %. Des tests PCR numériques

à 0,1 %
ont été effectués sur 20 échantillons à 0,1 % pour observer si une détection de 95 % était obtenue dans une plage de 0,05 à 0,15 %.

Fréquence de prévision LOD	0,01%	0,05%	0,10%
Taux de réussite	65%	95%	100%

À partir des données ci-dessus, on peut voir que 0,05 % est sélectionné comme limite de détection LOD du kit de détection.

Expérience 5 : Test de précision

Sélectionnez 20 échantillons avec un taux positif fort de 2 %, 20 échantillons avec un taux positif moyen de 1 % et 20 échantillons avec un taux positif faible de 0,2 % pour la détection PCR numérique.

	Élevé positif2 %	Moyenne Positif 1%	Faible Positif 0,2%
MOYENNE	1,9959%	1,0027%	0,1878%
SD	0.001039	0.001135	0.000295
CV%	5.2058	11.3177	15.7011
Incertitude de mesure	1,16%	2,53%	3,51%

À partir des données ci-dessus, on peut voir que sous les trois systèmes de détection de positif fort 2 %, moyen positif 1 % et faible positif 0,2 %, les erreurs se situent toutes dans une plage raisonnable et la précision est bonne.

Expérience 6 : Test de récupération

Tout d’abord, l’étalon négatif correspondant d’EGFR T790M a été utilisé pour effectuer une dilution limite sur 50 % de l’étalon, et chaque gradient a été dilué deux fois avec l’échantillon négatif, puis 11 échantillons ont été testés.

Échantillon	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
%AF	50.00	25.00	12.50	6.25	3.125	1.563	0.781	0.391	0.195	0.098	0.049
%Taux de récupération	99.0	100.1	99.4	108.8	95.6	91.1	112.2	92.4	84.8	81.3	82.1

D'après les données ci-dessus, on peut voir que lorsque la FA est comprise entre 0,05 % et 50 %, le taux de récupération correspondant est compris entre 80 et 120 %, ce qui est conforme aux attentes.

Expérience 7 : Test de répétabilité

Prélevez 10 échantillons standard avec différents AF (1 % ~ 50 %) et demandez à l'opérateur A et à l'opérateur B d'effectuer quatre tests le même jour.

Il ressort des données ci-dessus que le système de détection EGFR T790M est stable et reproductible.

Expérience 8 : Test de reproductibilité

Prélevez 10 échantillons standard avec différents AF (1 % ~ 50 %) et faites en sorte que l'opérateur ① A et l'opérateur B effectuent chacun quatre tests expérimentaux le même jour ; ② L'opérateur A effectue quatre tests expérimentaux respectivement le premier jour et le deuxième jour ; ③ L'opérateur A effectue quatre tests expérimentaux le premier jour et l'opérateur B effectue quatre tests expérimentaux le deuxième jour.

À partir des données ci-dessus, il ressort que le système de détection EGFR T790M est stable et reproductible chez différentes personnes et à différents moments.

CB-Gene a développé une gamme de kits de détection dPCR et validé leurs performances à l'aide de normes exclusives. Ces kits peuvent détecter des mutations génétiques, des fusions, des variations du nombre de copies et d’autres altérations génomiques. En outre, nous proposons des services de recherche basés sur la dPCR, tirant parti des avantages de la technique en matière de quantification absolue et de haute précision pour fournir à nos clients des tests d'échantillons fiables et de haute qualité.

Si vous souhaitez commander, veuillez nous contacter
Email : sales@cb-gene.com

Contactez-nous