Sondes d'amorce dPCR

Définition

dPCR (PCR numérique)

① Il s'agit de la technologie PCR de troisième génération et d'une innovation majeure après la PCR conventionnelle et la qPCR (PCR quantitative par fluorescence en temps réel).

② Un système de réaction PCR traditionnel est réparti uniformément en dizaines de milliers, voire en millions de minuscules gouttelettes ou puits de réaction, chaque unité agissant comme un « microréacteur » indépendant.

③Avantage clé : grâce à cette stratégie « diviser pour mieux régner », la dPCR peut quantifier directement et absolument le nombre de molécules cibles (sans avoir besoin d'une courbe standard) et a une sensibilité extrêmement élevée, permettant la détection de quantités extrêmement faibles d'acides nucléiques (telles que des mutations rares et des traces d'agents pathogènes).

Sonde d'amorce

Il s’agit d’un élément de détection couramment utilisé dans la technologie qPCR et est également largement utilisé en dPCR. On l’appelle généralement sonde TaqMan.

Composition:

1. Amorces : une paire de fragments d'ADN courts et simple brin qui reconnaissent spécifiquement la séquence d'ADN cible et lancent l'amplification.

2.Sonde : Une séquence d’ADN étiquetée encore plus courte. Il est étiqueté aux deux extrémités avec :

*Un reporter (par exemple, FAM) : émet un signal fluorescent à une extrémité.

*Un quencher (quencher) : supprime l'émission du reporter lorsque les deux entrent en contact.

*Principe de fonctionnement : lors de l'amplification PCR, l'enzyme Taq dégrade la sonde à mesure qu'elle étend le brin d'ADN, séparant les groupes rapporteur et extincteur et libérant un signal fluorescent. Chaque molécule cible amplifiée génère un signal fluorescent.

En résumé:

Les sondes d'amorces dPCR sont un ensemble hautement spécifique d'amorces et de sondes conçues pour les expériences de PCR numérique (dPCR). Leur objectif est de permettre à la technologie dPCR de détecter et de quantifier de manière précise et spécifique des quantités extrêmement faibles d’acide nucléique cible (ADN ou ARN) dans un échantillon.

Le rôle des amorces et des sondes dPCR

Dans un système dPCR, les fonctions principales des sondes amorces comprennent :

*Reconnaissance spécifique : les amorces se lient précisément aux extrémités de la séquence du gène cible détectée, garantissant que seul le segment d'acide nucléique d'intérêt (par exemple, un gène dans le nouveau coronavirus ou un site de mutation dans le cancer) est amplifié.

*Génération et amplification de signaux : les sondes convertissent le processus d'amplification invisible de l'acide nucléique en un signal fluorescent détectable. Chaque molécule cible amplifiée émet un signal fluorescent.

*Réalisation d'une quantification absolue : il s'agit de la fonctionnalité la plus puissante du dPCR. Une fois la réaction terminée, l’appareil analyse chaque gouttelette/puits. Les unités qui émettent de la fluorescence sont étiquetées « positives », tandis que celles qui ne le font pas sont étiquetées « négatives ». En comptant la proportion de gouttelettes positives et en appliquant le modèle statistique de distribution de Poisson, le nombre absolu de copies de la molécule cible dans l'échantillon d'origine (par exemple, le nombre de copies par millilitre) peut être directement calculé, éliminant complètement le besoin d'une courbe standard.

Lié à la maladie

La technologie amorce-sonde DPCR, en raison de sa très haute sensibilité, joue un rôle essentiel dans la recherche et le diagnostic de diverses maladies, en particulier dans les situations suivantes : 

1. Cancer

①Biopsie liquide : détection de l'ADN tumoral circulant (ADNc) dans le sang. L'ADNc est généralement présent à des niveaux très faibles et le dPCR peut détecter avec précision des mutations rares (telles que les mutations EGFR, KRAS et BRAF) dans l'ADNc, permettant ainsi un dépistage précoce du cancer, des conseils en matière de médicaments, une surveillance de l'efficacité et une détection de la résistance aux médicaments.

②Génomique du cancer : étude des variations du nombre de copies de gènes (CNV) et des gènes de fusion en faible abondance.

2. Maladies infectieuses

① Quantification précise de la charge virale : particulièrement adaptée aux scénarios nécessitant une surveillance extrêmement précise des niveaux viraux, tels que l'évaluation de l'efficacité thérapeutique du VIH, du VHB (virus de l'hépatite B) et du VHC (virus de l'hépatite C).

②Détection d'agents pathogènes rares : détection de niveaux extrêmement faibles d'agents pathogènes en présence d'acide nucléique de fond élevé, comme dans les infections à un stade précoce ou latentes.

3.Maladies génétiques

① Diagnostic prénatal : un test prénatal non invasif (NIPT) est effectué en analysant l'ADN fœtal acellulaire (ADNcff) dans le sang périphérique maternel pour dépister les aneuploïdies chromosomiques telles que le syndrome de Down. Cette méthode est plus sûre et plus précise que les méthodes traditionnelles.

② Maladies génétiques monogéniques : détection de petites différences dans la fréquence des allèles pour le dépistage des porteurs et le typage des maladies.

4.Autres domaines

Surveillance des rejets de greffe d'organe : la détection de l'ADN acellulaire dérivé du donneur (dd-cfDNA) fournit une alerte précoce en cas de rejet de greffe.

Scénarios d'application

Les sondes amorces dPCR ont un large éventail d'applications, principalement dans des domaines de pointe tels que la recherche scientifique et le diagnostic clinique :

1. Détection de cibles rares

Lorsque la séquence cible est présente à des niveaux extrêmement faibles (<0,1 %) dans un échantillon, ce qui la rend difficile à détecter à l’aide de la qPCR conventionnelle, la dPCR est l’outil de choix. Par exemple, surveiller les traces d’ADN de cellules cancéreuses restant après un traitement contre le cancer (maladie résiduelle minimale, MRD).

2. Scénarios nécessitant une quantification absolue

①Le numéro de copie précis, plutôt que les modifications relatives, est requis. Par exemple:

②Étalonnage de l'étalon de charge virale : développement de courbes étalons et d'étalons précis pour les expériences qPCR.

③Études sur l'expression des gènes : mesurer avec précision les niveaux de transcription des gènes faiblement exprimés.

④ Validation des résultats du séquençage de nouvelle génération (NGS) : valider et quantifier avec précision les mutations rares détectées par NGS.

3. Mesure précise dans des milieux complexes

Lorsque les échantillons contiennent de nombreuses séquences ou inhibiteurs similaires susceptibles d’affecter l’efficacité de la qPCR, la dPCR offre une plus grande robustesse aux interférences, ce qui donne des résultats plus fiables. Par exemple, détecter des mutations à basse fréquence dans un contexte d’abondance de gènes de type sauvage.

4.Développement de produits de diagnostic moléculaire

En tant que technologie de base des produits IVD (diagnostic in vitro), elle est utilisée pour développer des kits de dépistage précoce du cancer et de détection des maladies infectieuses très sensibles.