Lignées cellulaires stables intégrées aux lentivirus

Pour améliorer la biosécurité dans la production de lentivirus en laboratoire, les composants viraux non essentiels sont éliminés et les éléments essentiels sont distribués sur plusieurs plasmides.
Cette stratégie de conception a abouti à quatre générations de systèmes d’emballage lentiviraux largement utilisés :

Les plasmides de première génération comprennent (Figure 2) :
1. Le plasmide de transfert - contient le transgène et le LTR de type sauvage
2. Le plasmide d'emballage - contient l'intégralité du génome viral (gènes d'emballage, régulateurs et accessoires), moins seulement l'enveloppe.
3. Le plasmide d'enveloppe - contient l'env.

 

Les plasmides de quatrième génération comprennent (Figure 5) :

Figure 5 Système plasmidique lentiviral de quatrième génération

 

Les systèmes d’emballage lentiviral de quatrième génération sont optimisés pour le rendement viral, la facilité d’utilisation et une biosécurité améliorée. Ces systèmes incorporent des promoteurs inductibles par la tétracycline pour permettre une activation transcriptionnelle contrôlée, tout en conservant Tat pour obtenir une expression de haut niveau des composants viraux essentiels. Pour réduire davantage le risque de recombinaison, les éléments viraux clés tels que gag-pro et vpr-pol sont séparés sur plusieurs plasmides, augmentant ainsi la séparation génétique et minimisant la probabilité de formation de lentivirus compétents pour la réplication (RCL). Cette conception permet une production efficace de lentivirus tout en maintenant un niveau élevé de biosécurité. Il a été rapporté que les surnageants viraux non concentrés produits à l’aide de systèmes de quatrième génération atteignent des titres allant jusqu’à 5 × 10⁸ IFU/mL.

En résumé, grâce à des améliorations successives de la conception, les systèmes d’emballage lentiviraux de quatrième génération sont devenus largement adoptés en laboratoire, offrant un équilibre optimal entre sécurité, convivialité et rendement viral élevé.

 

1. Le packaging des lentivirus nécessite la sélection d’une lignée cellulaire productrice. HEK293T est couramment utilisé. Par rapport à HEK293, les cellules HEK293T expriment le grand antigène T SV40, permettant aux plasmides contenant l'origine de réplication SV40 de se répliquer de manière épisomique, ce qui entraîne un nombre de copies plus élevé. Les cellules HEK293T ont également une efficacité de transfection plus élevée et supportent des titres viraux plus élevés.

2. 293T/17 est un sous-clone de cellules 293T qui exprime également le grand antigène T SV40. Le clone 17 a été sélectionné pour son efficacité de transfection supérieure lors des tests.

3. 293FT est également un dérivé des cellules 293T, une variante à croissance rapide qui exprime également le grand antigène T SV40.

4. Les cellules Lenti-X 293 sont également un dérivé des cellules 293T qui expriment le grand antigène T SV40. Il a été rapporté que les cellules Lenti-X 293 peuvent contenir six fois plus de lentivirus que les cellules 293FT. 

 

5. Cellules 293T en suspension et divers dérivés de cellules en suspension. Les cellules en suspension peuvent atteindre des densités plus élevées et peuvent être étendues aux bioréacteurs. Ils ne contiennent pas de sérum, ce qui facilite la purification et la concentration en aval.

6. Des lignées cellulaires de production stables, avec les composants d'emballage nécessaires intégrés de manière stable dans l'hôte, simplifient le processus de production et garantissent la stabilité des lots du virus, éliminant ainsi le besoin d'un emballage individuel requis pour une transfection transitoire.

Figure 6 Schéma d'emballage des lentivirus

Les préparations lentivirales à titre élevé et de haute pureté sont essentielles pour une transduction efficace des cellules cibles. Par conséquent, les surnageants viraux récoltés nécessitent généralement une purification et une concentration supplémentaires avant les applications en aval.

 

Diverses méthodes sont disponibles pour la concentration et la purification des lentivirus. Le choix de l’approche dépend de facteurs tels que le volume de l’échantillon, la pureté requise, le temps de traitement et l’évolutivité. Les méthodes couramment utilisées comprennent les techniques basées sur la centrifugation, la filtration, la précipitation et la capture par affinité. Certaines méthodes, telles que l'ultracentrifugation, offrent une pureté élevée mais peuvent prendre du temps, tandis que d'autres, telles que la précipitation du polyéthylène glycol, sont plus rapides mais peuvent ne pas atteindre la même pureté. Des techniques plus récentes, telles que celles utilisant des nanoparticules magnétiques, permettent une concentration rapide et à haut rendement avec une manipulation minimale.

Ce qui suit est une description détaillée de certaines méthodes clés :
1. Centrifugation :
Centrifugation différentielle :
Cette méthode utilise différentes vitesses de centrifugation pour séparer les virus des débris cellulaires et autres composants en fonction de leur taille et de leur densité.
Ultracentrifugation :
Cette technique utilise des vitesses extrêmement élevées pour agglomérer le virus, le concentrant et le purifiant ainsi.
Ultrafiltration centrifuge :
Cette méthode utilise des membranes avec des seuils de poids moléculaire spécifiques pour filtrer les particules plus grosses et concentrer le virus. 

 

2. Filtration :
Filtration à flux tangentiel : Cette méthode utilise une membrane pour séparer les particules virales d'un liquide en vrac, permettant un flux et une concentration continus.
Adsorption/élution sur membrane : les virus peuvent être adsorbés sur des filtres à membrane spécifiques, puis élués à l'aide d'un tampon approprié.
 

3. Précipitation :
Précipitation du polyéthylène glycol (PEG) : le PEG est utilisé pour précipiter les virus à partir de la solution en vue de leur collecte et de leur concentration.
Coprécipitation : Dans certains cas, les virus peuvent être coprécipités avec d'autres substances (par exemple, des protéines) pour améliorer leur concentration.
 

4. Immunocapture :
capture basée sur les anticorps : les virus peuvent être capturés à l'aide d'anticorps qui se lient spécifiquement au virus, permettant ainsi l'isolement et la concentration.

5. Autres méthodes :
Nanoparticules magnétiques : Ces nanoparticules peuvent être utilisées pour capturer et concentrer des virus, offrant ainsi une concentration rapide et efficace.
Séparation acoustique : Cette méthode utilise des ondes sonores pour séparer les particules en fonction de leur taille et de leur densité, offrant potentiellement une méthode douce et efficace de concentration virale.
Condensation à base d'eau : Cette nouvelle technologie est en cours de développement pour échantillonner les virus dans l'air.

 

Le titre viral fait référence à la concentration de particules virales infectieuses dans une préparation et constitue un paramètre critique pour la transduction lentivirale. Après la concentration, les titres viraux sont généralement déterminés avant d'infecter les cellules cibles afin de garantir des résultats cohérents et reproductibles. Plusieurs méthodes sont disponibles pour mesurer le titre viral, notamment les tests sur plaques, les tests de formation de foyers et d'autres techniques de quantification basées sur l'infectiosité ou les particules.

1. Test de plaque :
Cette méthode consiste à infecter une monocouche de cellules hôtes avec des dilutions en série d’un échantillon viral.
Après incubation, des plaques visibles (zones de lyse ou de mort cellulaire) se forment et le nombre de plaques est compté.
Le titre est calculé en fonction du nombre de plages, du facteur de dilution et de la quantité de virus utilisée.

2. Test de foyer :
Semblable au test de plaque, cette méthode quantifie le nombre de foyers (zones de cellules infectées) formés après l'infection.
Le titre est déterminé en comptant les foyers et en tenant compte de la dilution et du volume.

3. Autres méthodes :
qPCR : quantifie l'ARN ou l'ADN viral, fournissant une mesure du total des particules virales.
ELISA : Détecte les antigènes viraux, fournissant une méthode de quantification de la charge virale.
Cytométrie en flux : peut être utilisée pour compter les cellules infectées uniques, en particulier celles exprimant des marqueurs fluorescents.

Figure 7. Produits présents dans le surnageant d'emballage lentiviral

 

Les méthodes physiques peuvent mesurer les particules fonctionnelles et non fonctionnelles libérées dans le surnageant, ainsi que les protéines de capside libres (par exemple, p24). Les méthodes de titrage fonctionnel mesurent spécifiquement les particules virales fonctionnelles.

 

Points importants à noter :
1. Titre infectieux vs titre physique :
Certaines méthodes mesurent le nombre de particules virales infectieuses (titre infectieux), tandis que d'autres mesurent le nombre total de particules virales (titre physique). Le titre infectieux reflète mieux la capacité du virus à infecter et à transduire. Cependant, la détection du titre infectieux prend généralement plus de temps, tandis que la détection du titre physique est plus rapide. Par conséquent, un type de méthode établit une relation de conversion entre le « titre infectieux » et le « titre physique ».
 

2. Quelle est la différence entre les unités formant des plaques (PFU), les unités de transduction (TU) et les unités infectieuses (IFU) ? Lequel reflète le mieux la quantité de virus actif utilisée ?
1) PFU (unité formant plaque) indique le nombre de virus infectieux ou vivants. Le PFU/ml est utilisé pour calibrer le titre viral en mesurant le nombre de plaques formées après l’infection virale et reflète la quantité de virus actif dans la préparation.
2) IFU (unité infectieuse) équivaut à PFU.
3) TU/ml : unités de transduction/ml, indique le nombre de particules virales biologiquement actives par millilitre de venin viral, c'est-à-dire le nombre de génomes viraux capables d'infecter et de pénétrer dans les cellules cibles. Il s’agit d’une unité de mesure couramment utilisée pour les lentivirus et reflète la quantité de virus actif dans une préparation.
Le nombre d’IFU est généralement inférieur au nombre de TU car toutes les particules virales qui pénètrent dans les cellules ne déclenchent pas avec succès une infection productive.

 

La transduction lentivirale consiste à intégrer le gène cible dans le génome de l'hôte. Ceci est réalisé en modifiant les enzymes transcriptase inverse et intégrase codées dans le vecteur lentiviral, permettant une expression soutenue du gène exogène. Contrairement à d’autres vecteurs viraux, les lentivirus peuvent transduire des cellules qui ne se divisent pas, ce qui offre des avantages uniques dans les applications de délivrance de gènes.

En établissant des lignées cellulaires stables, les lentivirus infectent les cellules hôtes. L'ADN de transcription inverse reste partiellement libre dans les cellules, tandis que l'enzyme intégrase intègre les séquences LTR 5' à 3' du vecteur lentiviral dans le génome hôte. Lors du dépistage sélectif de la résistance, les cellules non intégrées sont tuées et les cellules survivantes peuvent être développées pour établir des lignées cellulaires stables. Des études ont montré qu'il faut environ 10 à 14 jours pour que l'ADN non intégré soit complètement dégradé à mesure que les cellules se divisent, ce qui correspond également à la période de sélection sous pression de la résistance.

Les lentivirus (LV) sont des virus enveloppés dont le plus courant est le VSV-G. Ils pénètrent dans les cellules en se liant à des protéines spécifiques de la surface cellulaire (telles que le LDLR), puis en subissant une fusion membranaire et en injectant de l'ARN viral contenant leurs informations génétiques dans le cytoplasme. Cet ARN viral simple brin est converti en ADN par transcription inverse. L'ADN viral pénètre dans le noyau cellulaire et est intégré dans le génome de la cellule hôte par l'intégrase virale.

Figure 8 Diagramme schématique de l'intégration du lentivirus dans le génome hôte

 

1. Sélection de la MOI : une MOI trop faible entraînera une faible efficacité de transduction, tandis qu'une MOI trop élevée peut provoquer une cytotoxicité. Des expériences de titrage MOI sont nécessaires pour déterminer les conditions d’infection optimales.

2. Utilisation du polybrène : Le polybrène est un polycation qui réduit la répulsion de charge entre le virus et la membrane cellulaire, améliorant ainsi l'efficacité de la transduction. Cependant, si le dosage est inapproprié, il peut également endommager les cellules.

3. Calendrier : La transduction doit être effectuée dès que la viabilité cellulaire est rétablie, afin de garantir que les cellules soient dans une phase de prolifération active dès que possible.

4. Contrôle de la densité cellulaire : une densité cellulaire excessivement élevée augmente les coûts de transduction, tandis qu'une densité excessivement faible peut affecter l'efficacité. Il est recommandé de maintenir une densité cellulaire d’environ 1 à 2 × (10 ^ 5) cellules/mL.

5. Concentration virale et titre : le titre du lentivirus affecte directement l'efficacité de la transduction, soulignant l'importance de comprendre le titre viral et de contrôler l'addition virale.

6. Intégration : Des études pangénomiques sur l'intégration virale ont montré que les lentivirus s'intègrent le plus souvent dans des régions transcriptionnellement actives, des régions récemment impliquées dans des événements de translocation et d'autres emplacements génomiques « vulnérables », et cette préférence est conservée entre les espèces cibles. Si la tendance générale à l’intégration est connue, elle reste aléatoire et difficile à prévoir.

 

Enfin:

En raison de leur capacité à s’intégrer de manière stable dans le génome hôte et à prendre en charge l’expression transgénique à long terme, les vecteurs lentiviraux sont largement utilisés en recherche et en clinique. Les applications courantes incluent la génération de lignées cellulaires stables, la fourniture de bibliothèques CRISPR, le développement de modèles animaux et la recherche en thérapie génique. La transduction lentivirale offre une approche fiable et polyvalente de délivrance de gènes à travers un large éventail de types de cellules, y compris les cellules qui ne se divisent pas et qui sont souvent réfractaires aux autres méthodes de transduction. Une conception et une optimisation expérimentales minutieuses peuvent améliorer considérablement l’efficacité de la transduction et la stabilité de l’expression des gènes.

 

CB-Gene propose des services de construction de lignées cellulaires stables basés sur un « système d'intégration lentivirale ». Avec une expérience éprouvée de plus de 900 lignées cellulaires stables générées avec succès, nous apportons une expertise substantielle pour répondre à divers besoins en recherche et développement. Veuillez nous contacter pour discuter des exigences de votre projet.

PROJET		Transduction virale-Lentivirus
Applicabilité cellulaire		Presque toutes les lignées cellulaires
Efficacité		haut
Intégration aléatoire		Oui
Niveau de biosécurité		BL2
Capacité de transduction génétique		<4-5k
Taux positif après sélection		haut
Chronologie	Synthèse de gènes et construction plasmidique	4-5 semaines
	Paquet antivirus	1-2 semaines
	Sélection de cellules stables en piscine	1-2 semaines
	Cellule monoclonale	>3 semaines
	total	>9-11 semaines
Charge de travail		moyen