Liste de contrôle de validation du test de génotypage HLA : matériaux de référence, contrôles et performances analytiques

Les tests de génotypage HLA nécessitent une validation minutieuse car le système HLA contient un grand nombre d'allèles hautement polymorphes. Un résultat fiable dépend non seulement des amorces, des sondes, des produits chimiques de séquençage ou des logiciels d'analyse, mais également de l'adéquation des matériaux de référence, de la conception des contrôles et de la manière dont les performances analytiques sont mesurées.

Un plan de validation doit démontrer que le test peut identifier correctement les locus HLA et la résolution allélique prévus dans des conditions opératoires définies. Il doit également montrer comment la méthode fonctionne lorsque l'entrée d'ADN, les opérateurs, les lots de réactifs, les instruments ou les jours de test changent.

Cette liste de contrôle fournit un cadre pratique pour valider un test de génotypage HLA. Il se concentre sur les matériaux de référence, les contrôles positifs et négatifs, l'exactitude, la précision, la sensibilité analytique, la spécificité analytique, la plage de déclaration, les résultats invalides et la surveillance continue de la qualité.

Avant d'utiliser cette liste de contrôle, Les normes de référence HLA pour la validation des tests et le contrôle qualité peuvent fournir des informations supplémentaires sur le rôle des matériaux caractérisés dans l'évaluation du flux de travail HLA.

Points clés à retenir

• Définissez l’utilisation prévue, les loci cibles, la résolution allélique, le type d’échantillon et le format de rapport avant le début de la validation.

• Sélectionnez des matériaux de référence qui correspondent aux loci cibles du test, à la résolution du génotype, au format de l'échantillon et au flux de travail de test.

• Utiliser des contrôles positifs, négatifs, d’extraction, d’amplification et de contamination, le cas échéant.

• Évaluez l’exactitude, la répétabilité, la reproductibilité, la sensibilité analytique, la spécificité, la robustesse et les taux de résultats invalides.

• Établissez des critères d’acceptation avant les tests plutôt que de les ajuster une fois les résultats disponibles.

• Enregistrez les données brutes, les écarts, les versions de logiciels, les règles d'interprétation et l'approbation finale.

• Continuez à utiliser des contrôles appropriés après validation pour surveiller les performances des tests de routine.

Que devrait démontrer la validation du test HLA ?

La validation du test HLA doit fournir des preuves documentées que la méthode est adaptée à l'usage auquel elle est destinée. L’objectif n’est pas de prouver qu’un test peut identifier tous les allèles HLA existants. La diversité HLA étant étendue, le laboratoire doit définir une portée analytique réaliste et étayer cette portée par des preuves appropriées.

La validation doit répondre à plusieurs questions pratiques :

• Le test peut-il identifier correctement les locus cibles ?

• Peut-il distinguer les groupes d’allèles requis ou les désignations au niveau des allèles ?

• Produit-il des résultats cohérents lorsque les tests sont répétés ?

• Reste-t-il fiable avec différents opérateurs, jours, lots de réactifs ou instruments ?

• Quelle est l’apport d’ADN minimum acceptable ?

• Comment les résultats ambigus ou sans appel sont-ils traités ?

• Quels résultats sont considérés comme valides, invalides ou en dehors de la plage à déclarer ?

• Quels contrôles doivent être réussis avant qu'une analyse soit acceptée ?

La validation doit couvrir l'ensemble du flux de travail qui sera utilisé dans la pratique. Si le processus de routine comprend l’extraction, l’amplification, le séquençage, l’analyse des données et la création de rapports d’ADN, la validation ne doit pas évaluer uniquement l’étape finale de séquençage.

Étape 1 : Définir l'utilisation prévue et la portée de validation

La première partie de la liste de contrôle consiste à définir exactement ce pour quoi le test est conçu.

Application prévue

L'utilisation prévue peut inclure :

• Recherche HLA à locus unique

• Génotypage multi-locus

• Recherche d'appariement donateur-bénéficiaire

• Développement d'essais pharmacogénomiques

• Évaluation du kit HLA

• Comparaison des méthodes

• Contrôle qualité courant en laboratoire

• Recherche impliquant la variation de la population HLA

L'utilisation prévue détermine la quantité de preuves requises. Un test ciblé conçu pour identifier un allèle HLA-B ne nécessite pas la même portée de validation qu'un test multi-locus destiné à rapporter plusieurs loci de classe I et de classe II.

Lieux cibles

Documentez chaque locus inclus dans le test, tel que :

• HLA-A

• HLA-B

• HLA-C

• HLA-DRB1

• HLA-DQB1

• HLA-DPB1

• HLA-DQA1

• HLA-DPA1

• HLA-DRB3, HLA-DRB4 et HLA-DRB5

Ne décrivez pas un test comme « multi-locus » sans énumérer les loci réels couverts. Le matériel de référence doit contenir les résultats attribués pour les mêmes loci que ceux que le test est censé rapporter.

Résolution de frappe requise

Définissez si le test rapporte :

• Résultats au niveau de l'antigène

• Résultats des groupes d'allèles

• Désignations d'allèles à deux champs

• Désignations d'allèles à trois champs

• Désignations d'allèles à quatre champs

• Un résultat défini par séquence à plus haute résolution

• Un groupe allèle ambigu

Le laboratoire doit également préciser si le test rapporte un génotype, deux allèles possibles ou une liste de combinaisons d'allèles non résolues.

Type d’échantillon et de matériau

Le plan de validation doit identifier le type d'échantillon utilisé dans le flux de travail de routine, tel que l'ADN génomique ou un matériel à base de cellules humaines. Les facteurs importants comprennent :

• Concentration d'ADN

• Pureté de l'ADN

• Intégrité de l'ADN

• Méthode d'extraction

• Conditions de stockage

• Historique de gel-dégel

• Volume d'échantillon

• Inhibiteurs possibles

Un étalon de référence ajouté directement à une réaction PCR peut évaluer l'amplification, le séquençage et l'interprétation, mais il n'évalue pas nécessairement le processus d'extraction de l'ADN.

Étape 2 : Sélectionner les matériaux de référence HLA appropriés

Les matériaux de référence fournissent des génotypes attribués avec lesquels les résultats des tests peuvent être comparés. Leur valeur dépend de leur adéquation avec la portée analytique du test.

CB-Gene fournit un Catégorie de produits standard de référence HLA couvrant les matériaux de génotypage HLA à locus unique et multi-locus.

Faites correspondre le matériau de référence au locus cible

Pour un test ciblé, le matériel de référence doit contenir le locus cible spécifique et la désignation de l’allèle requis pour l’évaluation.

Gène CB Les normes HLA à locus unique couvrent principalement le typage HLA-B. Les informations sur le produit incluent les normes de référence HLA-B 27:04, HLA-B 27:05, HLA-B 57:01, HLA- B 15:02, HLA-B 58:01, HLA-B 13:01 et HLA-B*27:07.

Le La norme de génotypage HLA à locus unique est fournie sous forme d'ADN génomique et est destinée à la recherche. Sa méthode de vérification répertoriée est le séquençage PCR-SBT/Sanger.

Pour un flux de travail à large correspondance, un document de référence multi-locaux peut être plus approprié. Gène CB Les normes multi-locus de correspondance HLA couvrent un large groupe de loci HLA, notamment HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/3/4/5, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 et HLA-DQB1.

Confirmez le génotype et la résolution attribués

Avant de tester, enregistrez :

• Désignation d'allèle attribuée

• Lieux cibles

• Niveau de résolution

• Méthode de vérification

• Format du matériel

• Numéro de catalogue ou numéro de lot

• Certificat ou données techniques

• Conditions de stockage

• Informations sur l'expiration

La valeur attribuée doit être suffisamment détaillée pour prendre en charge la comparaison prévue. Si un test donne un résultat sur deux champs, un étalon avec uniquement une désignation de groupe allèle peut ne pas suffire. De même, un résultat de référence à haute résolution ne peut pas prouver les performances du test dans des régions de séquence que le test n’examine pas.

Tenir compte de la compatibilité des méthodes

Le matériel de référence doit être compatible avec le flux de travail sélectionné. Les questions pertinentes incluent :

• Le matériau est-il de l'ADN génomique ?

• Peut-il être utilisé dans les flux de travail PCR-SBT ou Sanger ?

• Est-il adapté aux NGS ciblés ?

• Est-il adapté au séquençage à lecture longue ?

• Entre-t-il dans le flux de travail avant ou après l’extraction de l’ADN ?

• Le matériau reproduit-il le fond d’échantillon attendu ?

• Le génotype attribué est-il étayé par une méthode de vérification appropriée ?

CB-Gene déclare que ses produits de référence HLA ont été évalués par séquençage Sanger, PCR-SBT ou séquençage de troisième génération, avec confirmation du génotype par alignement de séquences par rapport aux séquences de référence HLA. Ces informations doivent être comparées à la méthode en cours de validation.

Liste de contrôle pour la sélection des matériaux de référence

Étape 3 : Construire une stratégie de contrôle complète

Les contrôles doivent être placés aux étapes où des défaillances peuvent survenir. Un seul contrôle positif à la fin du flux de travail ne peut pas identifier toutes les sources d'erreur possibles.

Contrôle de génotypage positif

Un contrôle positif doit contenir un génotype HLA connu que le test est conçu pour détecter. Il peut être utilisé pour vérifier :

• Amplification de l'ADN

• Performances de l'amorce ou de la sonde

• Qualité du séquençage

• Affectation d'allèle

• Interprétation du logiciel

• Formatage du rapport

Pour un test à locus unique, un ou plusieurs standards spécifiques à un allèle peuvent suffire pour une évaluation initiale. Pour un test multi-locus, un contrôle couvrant plusieurs loci cibles peut fournir une meilleure preuve des performances du flux de travail intégré.

Contrôle négatif ou non ciblé

Un contrôle négatif ou non ciblé peut aider à évaluer si le test produit un résultat positif inapproprié pour une cible définie. Son adéquation dépend de la conception du test.

Par exemple, un test PCR-SSP ciblé peut nécessiter des échantillons dépourvus de la séquence cible. Un test basé sur le séquençage peut plutôt s'appuyer davantage sur des contrôles de contamination et des matériaux de discrimination allélique.

Le terme « contrôle négatif » doit donc être clairement défini dans le protocole. Il ne faut pas supposer qu’un échantillon générique négatif peut évaluer tous les aspects de la spécificité du génotypage HLA.

Contrôle sans modèle

Un contrôle sans modèle ne contient aucune matrice d’ADN ajoutée. Il est utilisé pour surveiller la contamination introduite lors de la préparation d’une réaction ou de l’amplification.

Si le contrôle sans modèle produit un signal d’amplification ou un résultat de séquence inattendu, l’analyse doit être étudiée avant que les résultats d’un patient ou d’un échantillon de recherche ne soient publiés.

Blanc d’extraction

Un blanc d’extraction passe par le processus d’extraction d’ADN sans échantillon biologique. Il permet d’identifier les contaminations introduites lors :

• Préparation des échantillons

• Réactifs d'extraction

• Matériel d'extraction

• Plans de travail

• Étapes de transfert

Si l'étalon HLA est ajouté seulement après l'extraction, il ne peut pas évaluer la contamination ou la récupération pendant l'étape d'extraction.

Amplification interne ou contrôle de processus

Lorsqu’il est soutenu par la conception du test, un contrôle interne peut aider à identifier :

• Inhibition de la PCR

• Échec de la réaction

• ADN insuffisant

• Préparation incorrecte des réactifs

• Mauvaise efficacité d'amplification

Le contrôle doit avoir défini des critères d'acceptation. Un contrôle présent mais non interprété de manière cohérente ne fournit pas de preuves significatives de qualité.

Règles d'acceptation des contrôles

Le protocole de validation doit indiquer :

• Quels contrôles doivent réussir

• Quelle qualité de signal ou de séquence est acceptable

• Comment les contrôles échoués affectent l’exécution

• Si un contrôle échoué nécessite des tests répétés

• Qui est autorisé à approuver ou rejeter une exécution

• Comment les échecs de contrôle sont documentés

Étape 4 : évaluer les performances analytiques

La section sur les performances analytiques doit être conçue autour du résultat réel du test HLA.

Précision

L'exactitude est l'accord entre le résultat du test et le résultat de référence attribué ou accepté.

L'évaluation de la précision peut inclure :

• Tests de matériaux de référence HLA caractérisés

• Comparer les résultats avec une méthode établie

• Comparaison des résultats à la même résolution

• Confirmer les résultats discordants à l'aide d'une méthode appropriée

• Évaluation des groupes d'allèles représentatifs

• Examiner le rapport final plutôt que seulement les données de séquence brutes

La comparaison doit faire la distinction entre un véritable désaccord entre les génotypes et une différence causée par le formatage de la nomenclature, la version de la base de données ou la résolution des rapports.

Par exemple, deux résultats peuvent sembler différents car l’un utilise un format d’allèle hérité tandis que l’autre utilise un format basé sur deux points. De telles différences doivent être normalisées avant de classer un résultat comme discordant.

Répétabilité

La répétabilité évalue les performances dans les mêmes conditions de fonctionnement. Envisagez de répéter le test en utilisant :

• Le même opérateur

• Le même instrument

• Le même lot de réactif

• Le même laboratoire

• Le même jour de test ou un intervalle de test court

La répétabilité doit évaluer à la fois l’attribution correcte des allèles et les mesures de qualité utilisées pour déterminer si un résultat est valide.

Reproductibilité

La reproductibilité évalue les performances lorsque les conditions normales de fonctionnement changent. Selon le laboratoire, cela peut inclure :

• Différents opérateurs

• Différentes journées de tests

• Différents lots de réactifs

• Différents instruments

• Différents lots de préparation d'ADN

• Différentes séances d'analyse

L’objectif est de déterminer si le test produit des résultats cohérents au-delà d’une seule analyse idéale.

Sensibilité analytique

Pour un test de génotypage HLA qualitatif, la sensibilité analytique concerne généralement la quantité et la qualité minimales d'ADN pouvant produire un résultat valide et correctement attribué.

La validation doit évaluer :

• Entrée minimale d'ADN

• Plage de concentration d'ADN

• Plage de pureté de l'ADN

• ADN dégradé, le cas échéant

• Échantillons à faible apport

• Détection d'allèles hétérozygotes

• Risque d'abandon d'allèle

• Tarifs invalides ou sans appel à des niveaux d'entrée inférieurs

Le laboratoire doit définir un apport minimum acceptable plutôt que de supposer que toute concentration mesurable d’ADN est appropriée.

Si le test est conçu pour une application spécifique à faible abondance ou à échantillons mixtes, la validation doit définir séparément la manière dont la détection des allèles mineurs est évaluée. Les critères d'acceptation doivent refléter l'utilisation réellement prévue.

Spécificité analytique

La spécificité analytique décrit la capacité du test à distinguer le génotype HLA prévu des séquences apparentées ou non cibles.

L’évaluation doit prendre en compte :

• Groupes d'allèles étroitement liés

• Allèles avec des régions de liaison aux amorces similaires

• Séquences de réactions croisées potentielles

• Amplification non spécifique

• Attribution d'allèle incorrecte causée par une couverture incomplète

• Interférence de l'ADN non cible

• Contamination entre échantillons

Le système HLA étant hautement polymorphe, la spécificité ne doit pas être démontrée avec un seul échantillon positif et un seul échantillon négatif. Le panel de tests doit inclure des génotypes représentatifs et problématiques chaque fois qu'ils sont pertinents pour la cible du test.

Plage et résolution à signaler

La plage à déclarer doit définir :

• Locus pouvant être signalés

• Groupes d'allèles pouvant être distingués

• Résolution maximale à signaler

• Régions de séquence couvertes

• Résultats ambigus acceptables

• Conditions qui nécessitent un non-appel

• Résultats nécessitant des tests supplémentaires

Un test ne doit pas rapporter une désignation d’allèle plus détaillée que ce que soutiennent ses preuves validées. Une profondeur de lecture élevée ou un signal d'amplification puissant ne compense pas les régions cibles manquantes ou les informations de phase non résolues.

Tarif invalide et sans appel

La validation doit établir à quelle fréquence le test produit :

• Résultats invalides

• Résultats sans appel

• Des résultats ambigus

• Échec de l'amplification

• Échec du séquençage

• Couverture insuffisante

• Attributions d'allèles non résolues

Le laboratoire doit définir des critères d'acceptation distincts pour les échecs techniques et les ambiguïtés biologiques. Un non-appel provoqué par une couverture de séquence inadéquate est différent d'un résultat ambigu provoqué par deux allèles partageant la même séquence testée.

Robustesse

La robustesse évalue si de petits changements réalistes dans les conditions de fonctionnement affectent le résultat. Les variables potentielles comprennent :

• Concentration d'ADN

• Variation de pipetage

• Température de recuit

• Temps de réaction

• Lot de réactifs

• Durée de stockage

• Nombre de cycles de gel-dégel

• Qualité des analyses de séquençage

• Seuil d'analyse

• Version du logiciel

Seules les variables pertinentes doivent être contestées. L'objectif est d'identifier les conditions pouvant survenir lors d'opérations de routine et de déterminer si elles pourraient modifier le génotype signalé.

Matrice de performances analytiques du génotypage HLA

Étape 5 : Concevoir l'exécution de validation

Un cycle de validation doit être planifié avant que les échantillons ne soient testés. Le protocole doit définir :

• Nombre et type de documents de référence

• Nombre de répétitions

• Placement des contrôles

• Opérateurs impliqués

• Journées de tests

• Lots de réactifs

• Instruments

• Randomisation de l'échantillon

• Procédure d'analyse des données

• Critères d'acceptation

• Règles pour les tests répétés

Les répétitions doivent être suffisantes pour évaluer la performance revendiquée. Un petit nombre de tests répétés peuvent démontrer une faisabilité de base, mais ils peuvent ne pas étayer les affirmations concernant la reproductibilité entre les opérateurs, les instruments ou les lots de réactifs.

La validation doit également inclure des conditions de défaillance représentatives, le cas échéant. Par exemple, un faible apport d’ADN, une amplification insuffisante ou une mauvaise qualité de séquence peuvent être délibérément évalués pour confirmer la manière dont le test traite les résultats invalides.

Étape 6 : Définir les règles de comparaison des résultats

Avant d'examiner les données, définissez la façon dont les résultats seront classés.

Accord exact

Le résultat observé correspond au résultat attribué à la résolution de rapport validée.

Équivalent acceptable

Le résultat observé utilise une convention de formatage différente mais représente la même désignation d'allèle. Cela peut inclure des formats de nomenclature hérités et basés sur deux points.

Accord partiel

Le résultat observé est conforme à une résolution inférieure mais ne prend pas en charge la désignation complète attribuée. Cela ne doit pas être considéré comme un accord total lorsque le test revendique un rapport à plus haute résolution.

Résultat discordant

Le résultat observé est en conflit avec le génotype attribué après exclusion des différences de nomenclature et de résolution.

Invalide ou sans appel

Le test ne génère pas de résultat à signaler en raison d’un échec des contrôles, d’un ADN insuffisant, d’une mauvaise amplification, d’une qualité de séquence inadéquate ou d’une analyse non résolue.

Toutes les règles de comparaison doivent être documentées dans le plan de validation. Le laboratoire doit éviter de modifier les critères de classification après avoir vu les résultats.

Étape 7 : Documenter la validation et approuver le test

Un dossier de validation complet doit comprendre :

• Protocole de validation

• Déclaration d'utilisation prévue

• Version du test

• Informations sur les amorces, les sondes, les kits et les réactifs

• Informations sur les instruments

• Versions du logiciel et de la base de données

• Certificats de matériaux de référence

• Configuration du contrôle

• Données brutes des instruments

• Fichiers de séquence ou d'amplification

• Rapports d'analyse

• Tableaux de comparaison des résultats

• Déviations et enquêtes

• Enregistrements ayant échoué

• Actions correctives

• Résumé final des performances

• Signatures et dates d'approbation

Le rapport final doit clairement indiquer si le test répond à ses critères d'acceptation prédéfinis. Si une limitation persiste, elle doit être décrite dans la section sur les plages à signaler ou sur l'interprétation.

La validation n'est pas complète lorsque le laboratoire obtient un ensemble de résultats corrects. Il est complet lorsque la méthode, les contrôles, les limites, les règles d'analyse et les conditions opératoires sont documentés et approuvés.

Étape 8 : Établir un contrôle qualité de routine après validation

Après validation, le laboratoire doit continuer à surveiller le test.

Le CQ de routine peut inclure :

• Tests de contrôle positif

• Tests de contrôle sans modèle

• Essais à blanc d’extraction

• Examen des tendances de contrôle

• Vérification des lots de réactifs

• Tests périodiques des matériaux de référence

• Révision des tarifs invalides et sans appel

• Contrôle de version des logiciels et des bases de données

• Enquête sur des modèles d'allèles inattendus

• Documentation des actions correctives

Un contrôle doit être utilisé à une fréquence adaptée au risque du test et au volume de test. Le laboratoire doit définir quand un nouveau lot de réactifs, un instrument, une version de logiciel, une conception d'amorce ou un algorithme d'interprétation nécessite une revalidation partielle ou complète.

Les déclencheurs potentiels de revalidation incluent :

• Changement des locus cibles

• Modification de la résolution des rapports

• Nouvelle conception d’amorce ou de sonde

• Nouvelle chimie de séquençage

• Nouvelle plateforme d'instruments

• Mise à jour majeure du logiciel

• Nouvelle version de la base de données HLA

• Changement de méthode d'extraction

• Échec important du contrôle

• Augmentation répétée des résultats de non-appel

Comment les normes CB-Gene HLA peuvent prendre en charge la validation

Les matériaux HLA de CB-Gene peuvent être sélectionnés en fonction de la portée du test en cours de développement.

Pour les flux de travail ciblés HLA-B ou à locus unique, le La norme de génotypage HLA à locus unique fournit du matériel d'ADN génomique caractérisé avec des attributions d'allèles répertoriées et des informations de vérification PCR-SBT/Sanger.

Pour des flux de travail de correspondance HLA plus larges, le La norme de génotypage multi-locus correspondant à HLA inclut plusieurs loci HLA et est répertoriée comme étant vérifiée par séquençage de troisième génération. Les informations sur le produit décrivent également la confirmation du génotype basée sur la séquence à l'aide de l'alignement de la base de données HLA.

Ces matériaux peuvent prendre en charge les études de précision, la comparaison des méthodes, la formation des opérateurs, l'évaluation de la répétabilité et le contrôle qualité de routine. Le laboratoire doit néanmoins confirmer que le matériau sélectionné correspond à ses propres locus cibles, sa résolution, son format d'échantillon et son utilisation prévue.

Erreurs courantes de validation du test HLA

Utiliser un seul contrôle positif

Un échantillon positif peut montrer que le test peut détecter un génotype, mais il ne démontre pas une large discrimination allélique ni une performance multi-locus.

Choisir une norme à la mauvaise résolution

Un contrôle attribué uniquement au niveau du groupe allèle ne peut pas valider entièrement une déclaration de déclaration à deux ou trois champs.

Traiter un contrôle ADN comme un contrôle d'extraction

Un étalon d'ADN génomique purifié ajouté après l'extraction ne peut pas démontrer la récupération de l'extraction ou le contrôle de la contamination au stade de l'extraction.

En supposant qu’une couverture de séquence élevée garantit la précision

Une couverture élevée ne résout pas les variantes en dehors de la région cible. Il ne résout pas non plus automatiquement l'ambiguïté de phase ou l'interprétation incorrecte de la base de données de référence.

Ignorer les résultats sans appel

Les résultats invalides et ambigus font partie des performances du test. Ils doivent être mesurés, étudiés et inclus dans le rapport de validation.

Modification des critères d'acceptation après les tests

Les critères d'acceptation doivent être définis avant l'exécution de la validation. Les ajuster après avoir examiné les résultats peut rendre la validation difficile à défendre.

Ne pas contrôler les versions des logiciels et des bases de données

L'attribution des allèles HLA dépend des règles d'analyse et des données de référence. Les versions des logiciels et des bases de données doivent être enregistrées et contrôlées tout au long de la validation et des tests de routine.

Liste de contrôle pratique de validation du test de génotypage HLA

Portée

• ☐ L'utilisation prévue est documentée.

• ☐ Les loci cibles sont répertoriés.

• ☐ La résolution allélique requise est définie.

• ☐ Les exigences en matière d’apport d’échantillons et d’ADN sont documentées.

• ☐ Les résultats déclarables et non déclarables sont définis.

Documents de référence

• ☐ Le génotype de référence est attribué.

• ☐ Le matériel de référence couvre les locus cibles.

• ☐ La méthode de vérification est documentée.

• ☐ Le format du matériau est compatible avec le flux de travail.

• ☐ Des informations sur le stockage et la stabilité sont disponibles.

• ☐ Le numéro de catalogue et le numéro de lot sont enregistrés.

Contrôles

• ☐ Un contrôle de génotypage positif est inclus.

• ☐ Aucun contrôle sans modèle n'est défini.

• ☐ Le blanc d’extraction est inclus lorsque l’extraction fait partie du flux de travail.

• ☐ L'amplification interne ou le contrôle du processus est évalué.

• ☐ Les règles de défaillance des contrôles sont documentées.

Performance analytique

• ☐ La précision est évaluée.

• ☐ La répétabilité est évaluée.

• ☐ La reproductibilité est évaluée.

• ☐ La sensibilité analytique ou l'apport minimum d'ADN est défini.

• ☐ La spécificité analytique est évaluée.

• ☐ La plage de déclaration est documentée.

• ☐ Les taux d'invalides et de non-appel sont mesurés.

• ☐ La robustesse est évaluée.

Documentation

• ☐ Les données brutes sont conservées.

• ☐ Les versions du logiciel et de la base de données sont enregistrées.

• ☐ Les écarts sont étudiés.

• ☐ Les critères d’acceptation sont appliqués de manière cohérente.

• ☐ Les conclusions finales de la validation sont approuvées.

• ☐ Les déclencheurs de revalidation sont définis.

Conclusion

Un test de génotypage HLA fiable nécessite plus qu’une analyse réussie d’amplification ou de séquençage. Le laboratoire doit démontrer que le flux de travail complet peut produire des résultats précis, cohérents et interprétables dans un cadre analytique clairement défini.

Les étapes de validation les plus importantes consistent à définir les locus et la résolution requis, à sélectionner les matériaux de référence appropriés, à établir des règles de contrôle, à évaluer les performances analytiques et à documenter tous les résultats par rapport à des critères d'acceptation prédéfinis. Les étalons à locus unique peuvent être appropriés pour les tests HLA-B ciblés, tandis que les matériaux multi-locus peuvent prendre en charge des flux de travail de correspondance HLA plus larges.

Après validation, les contrôles de routine, la surveillance des tendances, le contrôle des versions et les procédures de gestion des modifications aident à maintenir les performances au fil du temps. Lorsque les matériaux de référence et les contrôles sont intégrés dans un plan de validation structuré, les laboratoires peuvent identifier les limites plus tôt et rendre les résultats du génotypage HLA plus cohérents, comparables et défendables.

FAQ

Quel est le contrôle le plus important dans la validation du génotypage HLA ?

Un matériel de référence positif caractérisé est essentiel car il fournit un génotype attribué à des fins de comparaison. Cependant, des contrôles sans modèle, d'extraction et de processus peuvent également être nécessaires pour identifier la contamination ou les échecs du flux de travail.

Un étalon de référence HLA peut-il valider un test multi-locus ?

Pas toujours. La norme doit couvrir les locus et la résolution que le test prétend rapporter. Une norme à locus unique peut prendre en charge une validation ciblée, mais peut ne pas fournir de preuves suffisantes pour un vaste flux de travail multi-locus.

Comment la sensibilité analytique du génotypage HLA est-elle évaluée ?

Il est couramment évalué en testant différents niveaux d’entrée d’ADN et conditions de qualité. Le laboratoire doit déterminer l'entrée la plus faible qui produit encore une amplification, un séquençage, une attribution d'allèle et un rapport valides.

Que doit-il se passer en cas d'échec du contrôle ?

L'analyse doit être suspendue, la cause doit être étudiée et les échantillons concernés ne doivent pas être signalés tant que le problème n'est pas résolu. Les tests répétés et les actions correctives doivent être documentés.

Les documents de référence haute résolution valident-ils automatiquement les rapports haute résolution ?

Non. Le test doit couvrir les régions de séquence et les caractéristiques analytiques nécessaires pour distinguer la désignation allélique rapportée. Un résultat de référence détaillé ne peut pas compenser une couverture incomplète du test.

Quand un test HLA doit-il être revalidé ?

Une revalidation peut être nécessaire après des modifications des amorces, des loci cibles, de la chimie de séquençage, des instruments, des procédures d'extraction, des logiciels, des bases de données d'allèles, de la résolution des rapports ou d'autres conditions pouvant affecter le génotype signalé.