एचएलए जीनोटाइपिंग परख सत्यापन चेकलिस्ट: संदर्भ सामग्री, नियंत्रण और विश्लेषणात्मक प्रदर्शन

एचएलए जीनोटाइपिंग परख के लिए सावधानीपूर्वक सत्यापन की आवश्यकता होती है क्योंकि एचएलए प्रणाली में बड़ी संख्या में अत्यधिक बहुरूपी एलील होते हैं। एक विश्वसनीय परिणाम न केवल प्राइमर, जांच, अनुक्रमण रसायन विज्ञान, या विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर निर्भर करता है, बल्कि संदर्भ सामग्री की उपयुक्तता, नियंत्रण के डिजाइन और विश्लेषणात्मक प्रदर्शन को मापने के तरीके पर भी निर्भर करता है।

एक सत्यापन योजना को यह प्रदर्शित करना चाहिए कि परख परिभाषित परिचालन स्थितियों के तहत इच्छित एचएलए लोकी और एलील रिज़ॉल्यूशन की सही पहचान कर सकती है। इसे यह भी दिखाना चाहिए कि जब डीएनए इनपुट, ऑपरेटर, अभिकर्मक लॉट, उपकरण या परीक्षण के दिन बदलते हैं तो विधि कैसा प्रदर्शन करती है।

यह चेकलिस्ट एचएलए जीनोटाइपिंग परख को मान्य करने के लिए एक व्यावहारिक रूपरेखा प्रदान करती है। यह संदर्भ सामग्री, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण, सटीकता, परिशुद्धता, विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता, विश्लेषणात्मक विशिष्टता, रिपोर्ट करने योग्य सीमा, अमान्य परिणाम और चल रही गुणवत्ता निगरानी पर केंद्रित है।

इस चेकलिस्ट का उपयोग करने से पहले, परख सत्यापन और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एचएलए संदर्भ मानक एचएलए वर्कफ़्लो मूल्यांकन में विशिष्ट सामग्रियों की भूमिका पर अतिरिक्त पृष्ठभूमि प्रदान कर सकते हैं।

चाबी छीनना

• सत्यापन शुरू होने से पहले इच्छित उपयोग, लक्ष्य लोकी, एलील रिज़ॉल्यूशन, नमूना प्रकार और रिपोर्टिंग प्रारूप को परिभाषित करें।

• ऐसी संदर्भ सामग्री का चयन करें जो परख के लक्ष्य लोकी, जीनोटाइप रिज़ॉल्यूशन, नमूना प्रारूप और परीक्षण वर्कफ़्लो से मेल खाती हो।

• जहां उपयुक्त हो वहां सकारात्मक, नकारात्मक, निष्कर्षण, प्रवर्धन और संदूषण नियंत्रण का उपयोग करें।

• सटीकता, दोहराव, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता, विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता, विशिष्टता, मजबूती और अमान्य-परिणाम दरों का मूल्यांकन करें।

• परिणाम उपलब्ध होने के बाद उन्हें समायोजित करने के बजाय परीक्षण से पहले स्वीकृति मानदंड स्थापित करें।

• कच्चा डेटा, विचलन, सॉफ़्टवेयर संस्करण, व्याख्या नियम और अंतिम अनुमोदन रिकॉर्ड करें।

• नियमित परख प्रदर्शन की निगरानी के लिए सत्यापन के बाद उपयुक्त नियंत्रणों का उपयोग जारी रखें।

एचएलए परख सत्यापन क्या प्रदर्शित करना चाहिए?

एचएलए परख सत्यापन को दस्तावेजी साक्ष्य प्रदान करना चाहिए कि विधि अपने इच्छित उद्देश्य के लिए उपयुक्त है। लक्ष्य यह साबित करना नहीं है कि एक परख मौजूद प्रत्येक एचएलए एलील की पहचान कर सकती है। क्योंकि एचएलए विविधता व्यापक है, प्रयोगशाला को एक यथार्थवादी विश्लेषणात्मक दायरे को परिभाषित करना चाहिए और उचित साक्ष्य के साथ उस दायरे का समर्थन करना चाहिए।

सत्यापन को कई व्यावहारिक प्रश्नों का उत्तर देना चाहिए:

• क्या परख लक्ष्य लोकी की सही पहचान कर सकती है?

• क्या यह आवश्यक एलील समूहों या एलील-स्तरीय पदनामों को अलग कर सकता है?

• जब परीक्षण दोबारा किया जाता है तो क्या यह लगातार परिणाम देता है?

• क्या यह विभिन्न ऑपरेटरों, दिनों, अभिकर्मक लॉट या उपकरणों के साथ विश्वसनीय रहता है?

• न्यूनतम स्वीकार्य डीएनए इनपुट क्या है?

• अस्पष्ट या बिना कॉल वाले परिणामों को कैसे नियंत्रित किया जाता है?

• कौन से परिणाम वैध, अमान्य या रिपोर्ट करने योग्य सीमा से बाहर माने जाते हैं?

• किसी रन को स्वीकार करने से पहले किन नियंत्रणों से गुजरना होगा?

सत्यापन में संपूर्ण वर्कफ़्लो को शामिल किया जाना चाहिए जिसका उपयोग व्यवहार में किया जाएगा। यदि नियमित प्रक्रिया में डीएनए निष्कर्षण, प्रवर्धन, अनुक्रमण, डेटा विश्लेषण और रिपोर्टिंग शामिल है, तो सत्यापन को केवल अंतिम अनुक्रमण चरण का मूल्यांकन नहीं करना चाहिए।

चरण 1: इच्छित उपयोग और सत्यापन के दायरे को परिभाषित करें

चेकलिस्ट का पहला भाग यह परिभाषित करना है कि परख किस उद्देश्य से डिज़ाइन की गई है।

इच्छित आवेदन

इच्छित उपयोग में शामिल हो सकते हैं:

• एकल-लोकस एचएलए अनुसंधान

• मल्टी-लोकस जीनोटाइपिंग

• दाता-प्राप्तकर्ता मिलान अनुसंधान

• फार्माकोजेनोमिक परख विकास

• एचएलए किट मूल्यांकन

• विधि तुलना

• नियमित प्रयोगशाला गुणवत्ता नियंत्रण

• एचएलए जनसंख्या भिन्नता से संबंधित अनुसंधान

इच्छित उपयोग आवश्यक साक्ष्य की मात्रा निर्धारित करता है। एक एचएलए-बी एलील की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किए गए एक केंद्रित परख को कई वर्ग I और वर्ग II लोकी की रिपोर्ट करने के उद्देश्य से मल्टी-लोकस परख के समान सत्यापन दायरे की आवश्यकता नहीं होती है।

लक्ष्य लोकी

परख में शामिल प्रत्येक स्थान का दस्तावेजीकरण करें, जैसे:

• एचएलए-ए

• एचएलए-बी

• एचएलए-सी

• एचएलए-डीआरबी1

• एचएलए-DQB1

• एचएलए-DPB1

• एचएलए-DQA1

• एचएलए-डीपीए1

• HLA-DRB3, HLA-DRB4, और HLA-DRB5

कवर किए गए वास्तविक लोकी को सूचीबद्ध किए बिना किसी परख को 'मल्टी-लोकस' के रूप में वर्णित न करें। संदर्भ सामग्री में उसी लोकी के लिए निर्दिष्ट परिणाम शामिल होने चाहिए जिनकी परख रिपोर्ट करने की अपेक्षा की जाती है।

आवश्यक टाइपिंग रिज़ॉल्यूशन

परिभाषित करें कि क्या परख रिपोर्ट:

• एंटीजन-स्तर के परिणाम

• एलील-समूह परिणाम

• दो-क्षेत्र एलील पदनाम

• तीन-क्षेत्र एलील पदनाम

• चार-क्षेत्र एलील पदनाम

• एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन अनुक्रम-परिभाषित परिणाम

• एक अस्पष्ट एलील समूह

प्रयोगशाला को यह भी निर्दिष्ट करना चाहिए कि क्या परख एक जीनोटाइप, दो संभावित एलील, या अनसुलझे एलील संयोजनों की सूची की रिपोर्ट करती है।

नमूना और सामग्री प्रकार

सत्यापन योजना को नियमित वर्कफ़्लो में उपयोग किए जाने वाले नमूना प्रकार की पहचान करनी चाहिए, जैसे कि जीनोमिक डीएनए या मानव-कोशिका-आधारित सामग्री। महत्वपूर्ण कारकों में शामिल हैं:

• डीएनए एकाग्रता

• डीएनए शुद्धता

• डीएनए अखंडता

• निष्कर्षण विधि

• जमा करने की अवस्था

• फ्रीज-पिघलना इतिहास

• नमूना मात्रा

• संभावित अवरोधक

पीसीआर प्रतिक्रिया में सीधे जोड़ा गया एक संदर्भ मानक प्रवर्धन, अनुक्रमण और व्याख्या का मूल्यांकन कर सकता है, लेकिन यह आवश्यक रूप से डीएनए निष्कर्षण प्रक्रिया का मूल्यांकन नहीं करता है।

चरण 2: उपयुक्त एचएलए संदर्भ सामग्री का चयन करें

संदर्भ सामग्री निर्दिष्ट जीनोटाइप प्रदान करती है जिसके विरुद्ध परख परिणामों की तुलना की जा सकती है। उनका मूल्य इस बात पर निर्भर करता है कि वे परख के विश्लेषणात्मक दायरे से कितनी अच्छी तरह मेल खाते हैं।

सीबी-जीन एक प्रदान करता है एचएलए संदर्भ मानक उत्पाद श्रेणी जिसमें एकल-लोकस और मल्टी-लोकस एचएलए जीनोटाइपिंग सामग्री शामिल है।

संदर्भ सामग्री का लक्ष्य स्थान से मिलान करें

एक केंद्रित परख के लिए, संदर्भ सामग्री में मूल्यांकन के लिए आवश्यक विशिष्ट लक्ष्य स्थान और एलील पदनाम शामिल होना चाहिए।

सीबी-जीन सिंगल-लोकस एचएलए मानक मुख्य रूप से एचएलए-बी टाइपिंग को कवर करते हैं। उत्पाद जानकारी में HLA-B 27:04, HLA-B 27:05, HLA-B 57:01, HLA-B 15:02, HLA-B 58:01, HLA-B 13:01, और HLA-B*27:07 संदर्भ मानक शामिल हैं।

एचएलए सिंगल-लोकस जीनोटाइपिंग मानक जीनोमिक डीएनए के रूप में प्रदान किया जाता है और अनुसंधान उपयोग के लिए अभिप्रेत है। इसकी सूचीबद्ध सत्यापन विधि पीसीआर-एसबीटी/सेंगर अनुक्रमण है।

व्यापक मिलान वाले वर्कफ़्लो के लिए, मल्टी-लोकस संदर्भ सामग्री अधिक उपयुक्त हो सकती है। सीबी-जीन HLA मिलान वाले मल्टी-लोकस मानक HLA लोकी के एक व्यापक समूह को कवर करते हैं, जिनमें HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/3/4/5, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 और HLA-DQB1 शामिल हैं।

निर्दिष्ट जीनोटाइप और रिज़ॉल्यूशन की पुष्टि करें

परीक्षण से पहले, रिकॉर्ड करें:

• एलील पदनाम सौंपा गया

• लक्ष्य लोकी

• संकल्प स्तर

• सत्यापन विधि

• सामग्री प्रारूप

• कैटलॉग नंबर या लॉट नंबर

• प्रमाणपत्र या तकनीकी डेटा

• जमा करने की अवस्था

• समाप्ति की जानकारी

इच्छित तुलना का समर्थन करने के लिए निर्दिष्ट मान पर्याप्त विस्तृत होना चाहिए। यदि कोई परख दो-क्षेत्र परिणाम की रिपोर्ट करती है, तो केवल एलील-समूह पदनाम वाला मानक पर्याप्त नहीं हो सकता है। इसी तरह, एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन संदर्भ परिणाम उन अनुक्रम क्षेत्रों में परख प्रदर्शन को साबित नहीं कर सकता है जिनकी परख जांच नहीं करती है।

विधि अनुकूलता पर विचार करें

संदर्भ सामग्री चयनित वर्कफ़्लो के अनुकूल होनी चाहिए। प्रासंगिक प्रश्नों में शामिल हैं:

• क्या सामग्री जीनोमिक डीएनए है?

• क्या इसका उपयोग पीसीआर-एसबीटी या सेंगर वर्कफ़्लोज़ में किया जा सकता है?

• क्या यह लक्षित एनजीएस के लिए उपयुक्त है?

• क्या यह लंबे समय तक पढ़ी जाने वाली अनुक्रमणिका के लिए उपयुक्त है?

• क्या यह डीएनए निष्कर्षण से पहले या बाद में वर्कफ़्लो में प्रवेश करता है?

• क्या सामग्री अपेक्षित नमूना पृष्ठभूमि को दोहराती है?

• क्या निर्दिष्ट जीनोटाइप उचित सत्यापन विधि द्वारा समर्थित है?

सीबी-जीन का कहना है कि उसके एचएलए संदर्भ उत्पादों का मूल्यांकन सेंगर अनुक्रमण, पीसीआर-एसबीटी, या तीसरी पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग करके किया गया है, जिसमें एचएलए संदर्भ अनुक्रमों के खिलाफ अनुक्रम संरेखण के माध्यम से जीनोटाइप की पुष्टि की गई है। इस जानकारी की तुलना मान्य की जा रही विधि से की जानी चाहिए।

संदर्भ सामग्री चयन चेकलिस्ट

चरण 3: एक पूर्ण नियंत्रण रणनीति बनाएं

नियंत्रण उन चरणों पर रखा जाना चाहिए जहां विफलताएं हो सकती हैं। वर्कफ़्लो के अंत में एक भी सकारात्मक नियंत्रण त्रुटि के हर संभावित स्रोत की पहचान नहीं कर सकता है।

सकारात्मक जीनोटाइपिंग नियंत्रण

एक सकारात्मक नियंत्रण में एक ज्ञात एचएलए जीनोटाइप होना चाहिए जिसका पता लगाने के लिए परख को डिज़ाइन किया गया है। इसका उपयोग सत्यापित करने के लिए किया जा सकता है:

• डीएनए प्रवर्धन

• प्राइमर या जांच प्रदर्शन

• अनुक्रमण गुणवत्ता

• एलील असाइनमेंट

• सॉफ्टवेयर व्याख्या

• रिपोर्ट स्वरूपण

एकल-लोकस परख के लिए, प्रारंभिक मूल्यांकन के लिए एक या अधिक एलील-विशिष्ट मानक पर्याप्त हो सकते हैं। मल्टी-लोकस परख के लिए, कई लक्ष्य लोकी को कवर करने वाला नियंत्रण एकीकृत वर्कफ़्लो प्रदर्शन का बेहतर सबूत प्रदान कर सकता है।

नकारात्मक या गैर-लक्ष्य नियंत्रण

एक नकारात्मक या गैर-लक्ष्य नियंत्रण यह आकलन करने में मदद कर सकता है कि क्या परख किसी परिभाषित लक्ष्य के लिए अनुचित सकारात्मक परिणाम उत्पन्न करती है। इसकी उपयुक्तता परख डिजाइन पर निर्भर करती है।

उदाहरण के लिए, लक्षित पीसीआर-एसएसपी परख के लिए ऐसे नमूनों की आवश्यकता हो सकती है जिनमें लक्ष्य अनुक्रम का अभाव हो। अनुक्रमण-आधारित परख इसके बजाय संदूषण नियंत्रण और एलील-भेदभाव सामग्री पर अधिक निर्भर हो सकती है।

इसलिए 'नकारात्मक नियंत्रण' शब्द को प्रोटोकॉल में स्पष्ट रूप से परिभाषित किया जाना चाहिए। यह नहीं माना जाना चाहिए कि एक सामान्य नकारात्मक नमूना एचएलए जीनोटाइपिंग विशिष्टता के हर पहलू का मूल्यांकन कर सकता है।

नो-टेम्पलेट नियंत्रण

नो-टेम्पलेट नियंत्रण में कोई जोड़ा गया डीएनए टेम्प्लेट नहीं होता है। इसका उपयोग प्रतिक्रिया की तैयारी या प्रवर्धन के दौरान पेश किए गए संदूषण की निगरानी के लिए किया जाता है।

यदि नो-टेम्पलेट नियंत्रण अप्रत्याशित प्रवर्धन संकेत या अनुक्रम परिणाम उत्पन्न करता है, तो किसी भी रोगी या शोध नमूना परिणाम जारी होने से पहले रन की जांच की जानी चाहिए।

निष्कासन रिक्त

एक निष्कर्षण ब्लैंक जैविक नमूने के बिना डीएनए निष्कर्षण प्रक्रिया से गुजरता है। यह निम्नलिखित के दौरान उत्पन्न संदूषण की पहचान करने में मदद करता है:

• नमूना तैयार करना

• निष्कर्षण अभिकर्मक

• निष्कर्षण उपकरण

• काम की सतहें

• स्थानांतरण चरण

यदि एचएलए मानक केवल निष्कर्षण के बाद जोड़ा जाता है, तो यह निष्कर्षण चरण के दौरान संदूषण या पुनर्प्राप्ति का मूल्यांकन नहीं कर सकता है।

आंतरिक प्रवर्धन या प्रक्रिया नियंत्रण

जहां परख डिजाइन द्वारा समर्थित है, एक आंतरिक नियंत्रण पहचानने में मदद कर सकता है:

• पीसीआर निषेध

• प्रतिक्रिया विफलता

• अपर्याप्त डीएनए

• गलत अभिकर्मक तैयारी

• ख़राब प्रवर्धन दक्षता

नियंत्रण में परिभाषित स्वीकृति मानदंड होने चाहिए। एक नियंत्रण जो मौजूद है लेकिन लगातार व्याख्या नहीं की गई है वह सार्थक गुणवत्ता साक्ष्य प्रदान नहीं करता है।

नियंत्रण स्वीकृति नियम

सत्यापन प्रोटोकॉल में यह लिखा होना चाहिए:

• कौन से नियंत्रण पास होने चाहिए

• कौन सा सिग्नल या अनुक्रम गुणवत्ता स्वीकार्य है

• विफल नियंत्रण रन को कैसे प्रभावित करते हैं

• क्या असफल नियंत्रण के लिए दोबारा परीक्षण की आवश्यकता है

• जो किसी रन को स्वीकृत या अस्वीकार करने के लिए अधिकृत है

• नियंत्रण विफलताओं को कैसे प्रलेखित किया जाता है

चरण 4: विश्लेषणात्मक प्रदर्शन का मूल्यांकन करें

विश्लेषणात्मक प्रदर्शन अनुभाग को एचएलए परख के वास्तविक आउटपुट के आसपास डिजाइन किया जाना चाहिए।

शुद्धता

सटीकता परख परिणाम और निर्दिष्ट या स्वीकृत संदर्भ परिणाम के बीच का समझौता है।

सटीकता मूल्यांकन में शामिल हो सकते हैं:

• विशेषता एचएलए संदर्भ सामग्री का परीक्षण

• स्थापित पद्धति से परिणामों की तुलना करना

• समान रिज़ॉल्यूशन पर परिणामों की तुलना करना

• उचित विधि का उपयोग करके असंगत परिणामों की पुष्टि करना

• प्रतिनिधि एलील समूहों का मूल्यांकन

• केवल कच्चे अनुक्रम डेटा के बजाय अंतिम रिपोर्ट की समीक्षा करना

तुलना को वास्तविक जीनोटाइप असहमति और नामकरण स्वरूपण, डेटाबेस संस्करण, या रिपोर्टिंग रिज़ॉल्यूशन के कारण होने वाले अंतर के बीच अंतर करना चाहिए।

उदाहरण के लिए, दो परिणाम अलग-अलग दिखाई दे सकते हैं क्योंकि एक लीगेसी एलील प्रारूप का उपयोग करता है जबकि दूसरा कोलन-आधारित प्रारूप का उपयोग करता है। किसी परिणाम को असंगत के रूप में वर्गीकृत करने से पहले ऐसे मतभेदों को सामान्यीकृत किया जाना चाहिए।

repeatability

दोहराव योग्यता समान परिचालन स्थितियों के तहत प्रदर्शन का मूल्यांकन करती है। निम्नलिखित का उपयोग करके परख दोहराने पर विचार करें:

• वही ऑपरेटर

• वही यंत्र

• वही अभिकर्मक लॉट

• वही प्रयोगशाला

• समान परीक्षण दिवस या छोटा परीक्षण अंतराल

पुनरावृत्ति को सही एलील असाइनमेंट और गुणवत्ता मेट्रिक्स दोनों का आकलन करना चाहिए जो यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है कि परिणाम वैध है या नहीं।

reproducibility

सामान्य परिचालन स्थितियों में परिवर्तन होने पर पुनरुत्पादन क्षमता प्रदर्शन का मूल्यांकन करती है। प्रयोगशाला के आधार पर, इसमें शामिल हो सकते हैं:

• अलग-अलग ऑपरेटर

• अलग-अलग परीक्षण के दिन

• विभिन्न अभिकर्मक लॉट

• विभिन्न उपकरण

• विभिन्न डीएनए तैयारी बैच

• विभिन्न विश्लेषण सत्र

लक्ष्य यह निर्धारित करना है कि क्या परख एक आदर्श दौड़ से परे लगातार परिणाम देती है।

विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता

गुणात्मक एचएलए जीनोटाइपिंग परख के लिए, विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता आमतौर पर डीएनए की न्यूनतम मात्रा और गुणवत्ता से संबंधित होती है जो एक वैध और सही ढंग से निर्दिष्ट परिणाम उत्पन्न कर सकती है।

सत्यापन का मूल्यांकन करना चाहिए:

• न्यूनतम डीएनए इनपुट

• डीएनए सांद्रण सीमा

• डीएनए शुद्धता रेंज

• यदि प्रासंगिक हो तो विकृत डीएनए

• कम-इनपुट नमूने

• विषमयुग्मजी एलील का पता लगाना

• एलील ड्रॉपआउट जोखिम

• निम्न इनपुट स्तरों पर अमान्य या नो-कॉल दरें

प्रयोगशाला को यह मानने के बजाय कि कोई मापने योग्य डीएनए सांद्रता उपयुक्त है, न्यूनतम स्वीकार्य इनपुट परिभाषित करना चाहिए।

यदि परख एक विशिष्ट कम-बहुतायत या मिश्रित-नमूना अनुप्रयोग के लिए डिज़ाइन की गई है, तो सत्यापन को अलग से परिभाषित करना चाहिए कि मामूली एलील पहचान का मूल्यांकन कैसे किया जाता है। स्वीकृति मानदंड को वास्तविक इच्छित उपयोग को प्रतिबिंबित करना चाहिए।

विश्लेषणात्मक विशिष्टता

विश्लेषणात्मक विशिष्टता संबंधित या गैर-लक्ष्य अनुक्रमों से इच्छित एचएलए जीनोटाइप को अलग करने की परख की क्षमता का वर्णन करती है।

मूल्यांकन पर विचार करना चाहिए:

• निकट से संबंधित एलील समूह

• समान प्राइमर-बाइंडिंग क्षेत्रों वाले एलील्स

• संभावित क्रॉस-रिएक्टिव अनुक्रम

• गैर-विशिष्ट प्रवर्धन

• अपूर्ण कवरेज के कारण गलत एलील असाइनमेंट

• गैर-लक्ष्य डीएनए से हस्तक्षेप

• नमूनों के बीच संदूषण

क्योंकि एचएलए प्रणाली अत्यधिक बहुरूपी है, विशिष्टता को केवल एक सकारात्मक और एक नकारात्मक नमूने के साथ प्रदर्शित नहीं किया जाना चाहिए। परीक्षण पैनल में प्रतिनिधि चुनौतीपूर्ण जीनोटाइप को शामिल करना चाहिए जब भी वे परख के लक्ष्य के लिए प्रासंगिक हों।

रिपोर्ट करने योग्य रेंज और रिज़ॉल्यूशन

रिपोर्ट करने योग्य सीमा को परिभाषित करना चाहिए:

• लोकी जिसे रिपोर्ट किया जा सकता है

• एलील समूह जिन्हें अलग किया जा सकता है

• अधिकतम रिपोर्टयोग्य संकल्प

• अनुक्रम क्षेत्र कवर किए गए

• स्वीकार्य अस्पष्ट परिणाम

• ऐसी स्थितियाँ जिनमें नो-कॉल की आवश्यकता होती है

• ऐसे परिणाम जिनके लिए पूरक परीक्षण की आवश्यकता होती है

किसी परख को उसके मान्य साक्ष्य समर्थन से अधिक विस्तृत एलील पदनाम की रिपोर्ट नहीं करनी चाहिए। उच्च पढ़ने की गहराई या एक मजबूत प्रवर्धन संकेत लापता लक्ष्य क्षेत्रों या अनसुलझे चरण की जानकारी के लिए क्षतिपूर्ति नहीं करता है।

अमान्य और नो-कॉल दर

सत्यापन को यह स्थापित करना चाहिए कि परख कितनी बार उत्पन्न होती है:

• अमान्य परिणाम

• नो-कॉल परिणाम

• अस्पष्ट परिणाम

• विफल प्रवर्धन

• विफल अनुक्रमण

• अपर्याप्त कवरेज

• अनसुलझे एलील असाइनमेंट

प्रयोगशाला को तकनीकी विफलता और जैविक अस्पष्टता के लिए अलग-अलग स्वीकृति मानदंड परिभाषित करना चाहिए। अपर्याप्त अनुक्रम कवरेज के कारण होने वाली नो-कॉल एक ही परीक्षण किए गए अनुक्रम को साझा करने वाले दो एलील्स के कारण होने वाले अस्पष्ट परिणाम से भिन्न होती है।

मजबूती

मजबूती यह मूल्यांकन करती है कि परिचालन स्थितियों में छोटे, यथार्थवादी परिवर्तन परिणाम को प्रभावित करते हैं या नहीं। संभावित चर में शामिल हैं:

• डीएनए एकाग्रता

• पिपेटिंग भिन्नता

• एनीलिंग तापमान

• समय की प्रतिक्रिया

• अभिकर्मक लॉट

• भण्डारण अवधि

• फ्रीज-पिघलना चक्रों की संख्या

• अनुक्रमण रन गुणवत्ता

• विश्लेषण सीमा

• सॉफ़्टवेयर संस्करण

केवल प्रासंगिक चरों को ही चुनौती दी जानी चाहिए। इसका उद्देश्य उन स्थितियों की पहचान करना है जो नियमित ऑपरेशन के दौरान उत्पन्न हो सकती हैं और यह निर्धारित करना है कि क्या वे रिपोर्ट किए गए जीनोटाइप को बदल सकते हैं।

एचएलए जीनोटाइपिंग विश्लेषणात्मक प्रदर्शन मैट्रिक्स

चरण 5: वैलिडेशन रन डिज़ाइन करें

नमूनों का परीक्षण करने से पहले एक सत्यापन अभियान की योजना बनाई जानी चाहिए। प्रोटोकॉल को परिभाषित करना चाहिए:

• संदर्भ सामग्री की संख्या और प्रकार

• प्रतिकृतियों की संख्या

• प्लेसमेंट पर नियंत्रण रखें

• संचालक शामिल

• परीक्षण के दिन

• अभिकर्मक बहुत सारे

• उपकरण

• नमूना यादृच्छिकीकरण

• डेटा विश्लेषण प्रक्रिया

• स्वीकृति मानदंड

• दोबारा परीक्षण के नियम

किए जा रहे प्रदर्शन दावे का मूल्यांकन करने के लिए प्रतिकृतियां पर्याप्त होनी चाहिए। बार-बार किए गए परीक्षणों की एक छोटी संख्या बुनियादी व्यवहार्यता प्रदर्शित कर सकती है, लेकिन यह ऑपरेटरों, उपकरणों या अभिकर्मक लॉट में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता के दावों का समर्थन नहीं कर सकती है।

सत्यापन में जहां उपयुक्त हो वहां प्रतिनिधि विफलता की शर्तें भी शामिल होनी चाहिए। उदाहरण के लिए, कम डीएनए इनपुट, अपर्याप्त प्रवर्धन, या खराब अनुक्रम गुणवत्ता का जानबूझकर मूल्यांकन किया जा सकता है ताकि यह पुष्टि की जा सके कि परख अमान्य परिणामों को कैसे संभालती है।

चरण 6: परिणाम-तुलना नियम परिभाषित करें

डेटा की समीक्षा करने से पहले, परिभाषित करें कि परिणामों को कैसे वर्गीकृत किया जाएगा।

सटीक समझौता

देखा गया परिणाम मान्य रिपोर्टिंग रिज़ॉल्यूशन पर निर्दिष्ट परिणाम से मेल खाता है।

स्वीकार्य समतुल्य

देखा गया परिणाम एक भिन्न स्वरूपण परंपरा का उपयोग करता है लेकिन समान एलील पदनाम का प्रतिनिधित्व करता है। इसमें विरासत और कोलन-आधारित नामकरण प्रारूप शामिल हो सकते हैं।

आंशिक समझौता

देखा गया परिणाम कम रिज़ॉल्यूशन पर सहमत है लेकिन पूर्ण निर्दिष्ट पदनाम का समर्थन नहीं करता है। जब परख उच्च-रिज़ॉल्यूशन रिपोर्टिंग का दावा करती है तो इसे पूर्ण सहमति के रूप में नहीं गिना जाना चाहिए।

असंगत परिणाम

नामकरण और संकल्प मतभेदों को बाहर करने के बाद देखे गए परिणाम निर्दिष्ट जीनोटाइप के साथ टकराव करते हैं।

अमान्य या नो-कॉल

असफल नियंत्रण, अपर्याप्त डीएनए, खराब प्रवर्धन, अपर्याप्त अनुक्रम गुणवत्ता, या अनसुलझे विश्लेषण के कारण परख रिपोर्ट करने योग्य परिणाम उत्पन्न नहीं करती है।

सभी तुलना नियमों को सत्यापन योजना में प्रलेखित किया जाना चाहिए। प्रयोगशाला को परिणाम देखने के बाद वर्गीकरण मानदंड बदलने से बचना चाहिए।

चरण 7: सत्यापन का दस्तावेजीकरण करें और परख को मंजूरी दें

एक पूर्ण सत्यापन फ़ाइल में शामिल होना चाहिए:

• सत्यापन प्रोटोकॉल

• इच्छित उपयोग कथन

• परख संस्करण

• प्राइमर, जांच, किट और अभिकर्मक जानकारी

• उपकरण की जानकारी

• सॉफ़्टवेयर और डेटाबेस संस्करण

• संदर्भ सामग्री प्रमाणपत्र

• नियंत्रण विन्यास

• कच्चा उपकरण डेटा

• अनुक्रम या प्रवर्धन फ़ाइलें

• विश्लेषण रिपोर्ट

• परिणाम-तुलना तालिकाएँ

• विचलन और जांच

• विफल-रन रिकॉर्ड

• सुधारात्मक कार्रवाई

• अंतिम प्रदर्शन सारांश

• अनुमोदन हस्ताक्षर और तारीखें

अंतिम रिपोर्ट में स्पष्ट रूप से बताया जाना चाहिए कि क्या परख अपने पूर्वनिर्धारित स्वीकृति मानदंडों को पूरा करती है। यदि कोई सीमा रह जाती है, तो उसे रिपोर्ट योग्य-श्रेणी या व्याख्या अनुभाग में वर्णित किया जाना चाहिए।

जब प्रयोगशाला को सही परिणामों का एक सेट प्राप्त होता है तो सत्यापन पूरा नहीं होता है। यह तब पूर्ण होता है जब विधि, नियंत्रण, सीमाएँ, विश्लेषण नियम और परिचालन स्थितियाँ प्रलेखित और अनुमोदित हो जाती हैं।

चरण 8: सत्यापन के बाद नियमित गुणवत्ता नियंत्रण स्थापित करें

सत्यापन के बाद, प्रयोगशाला को परख की निगरानी जारी रखनी चाहिए।

नियमित QC में शामिल हो सकते हैं:

• सकारात्मक नियंत्रण परीक्षण

• नो-टेम्पलेट नियंत्रण परीक्षण

• निष्कर्षण रिक्त परीक्षण

• नियंत्रण प्रवृत्ति समीक्षा

• अभिकर्मक-लॉट सत्यापन

• आवधिक संदर्भ-सामग्री परीक्षण

• अमान्य और नो-कॉल दरों की समीक्षा

• सॉफ्टवेयर और डेटाबेस संस्करण नियंत्रण

• अप्रत्याशित एलील पैटर्न की जांच

• सुधारात्मक कार्रवाइयों का दस्तावेज़ीकरण

परख जोखिम और परीक्षण मात्रा के लिए उपयुक्त आवृत्ति पर नियंत्रण का उपयोग किया जाना चाहिए। प्रयोगशाला को यह परिभाषित करना चाहिए कि किसी नए अभिकर्मक लॉट, उपकरण, सॉफ़्टवेयर संस्करण, प्राइमर डिज़ाइन, या व्याख्या एल्गोरिदम को आंशिक या पूर्ण पुनर्वैधीकरण की आवश्यकता कब होती है।

संभावित पुनर्वैधीकरण ट्रिगर में शामिल हैं:

• लक्ष्य लोकी में परिवर्तन

• रिपोर्टिंग समाधान में परिवर्तन

• नया प्राइमर या जांच डिज़ाइन

• नई अनुक्रमण रसायन शास्त्र

• नया उपकरण मंच

• प्रमुख सॉफ़्टवेयर अद्यतन

• नया HLA डेटाबेस संस्करण

• निष्कर्षण विधि में परिवर्तन

• महत्वपूर्ण नियंत्रण विफलता

• नो-कॉल परिणामों में बार-बार वृद्धि

सीबी-जीन एचएलए मानक कैसे सत्यापन का समर्थन कर सकते हैं

सीबी-जीन की एचएलए सामग्री को विकसित किए जा रहे परख के दायरे के अनुसार चुना जा सकता है।

केंद्रित एचएलए-बी या एकल-लोकस वर्कफ़्लो के लिए, एचएलए सिंगल-लोकस जीनोटाइपिंग मानक सूचीबद्ध एलील असाइनमेंट और पीसीआर-एसबीटी/सेंगर सत्यापन जानकारी के साथ विशिष्ट जीनोमिक डीएनए सामग्री प्रदान करता है।

व्यापक एचएलए मिलान वर्कफ़्लो के लिए, एचएलए मिलान मल्टी-लोकस जीनोटाइपिंग मानक में कई एचएलए लोकी शामिल हैं और इसे तीसरी पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा सत्यापित किए जाने के रूप में सूचीबद्ध किया गया है। उत्पाद जानकारी एचएलए डेटाबेस संरेखण का उपयोग करके अनुक्रम-आधारित जीनोटाइप पुष्टिकरण का भी वर्णन करती है।

ये सामग्रियां सटीकता अध्ययन, विधि तुलना, ऑपरेटर प्रशिक्षण, दोहराव मूल्यांकन और नियमित गुणवत्ता नियंत्रण का समर्थन कर सकती हैं। प्रयोगशाला को अभी भी पुष्टि करनी चाहिए कि चयनित सामग्री अपने लक्ष्य लोकी, रिज़ॉल्यूशन, नमूना प्रारूप और इच्छित उपयोग से मेल खाती है।

सामान्य एचएलए परख सत्यापन गलतियाँ

केवल एक सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करना

एक सकारात्मक नमूना दिखा सकता है कि परख एक जीनोटाइप का पता लगा सकती है, लेकिन यह व्यापक एलील भेदभाव या मल्टी-लोकस प्रदर्शन प्रदर्शित नहीं करता है।

गलत रिज़ॉल्यूशन पर एक मानक चुनना

केवल एलील-समूह स्तर पर सौंपा गया नियंत्रण दो-फ़ील्ड या तीन-फ़ील्ड रिपोर्टिंग दावे को पूरी तरह से मान्य नहीं कर सकता है।

डीएनए नियंत्रण को निष्कर्षण नियंत्रण के रूप में मानना

निष्कर्षण के बाद जोड़ा गया एक शुद्ध जीनोमिक डीएनए मानक निष्कर्षण पुनर्प्राप्ति या निष्कर्षण-चरण संदूषण नियंत्रण प्रदर्शित नहीं कर सकता है।

यह मानते हुए कि उच्च अनुक्रम कवरेज सटीकता की गारंटी देता है

उच्च कवरेज लक्ष्य क्षेत्र के बाहर वेरिएंट का समाधान नहीं करता है। यह चरण अस्पष्टता या गलत संदर्भ डेटाबेस व्याख्या को स्वचालित रूप से हल नहीं करता है।

नो-कॉल परिणामों को अनदेखा करना

अमान्य और अस्पष्ट परिणाम परख प्रदर्शन का हिस्सा हैं। उन्हें मापा जाना चाहिए, जांच की जानी चाहिए और सत्यापन रिपोर्ट में शामिल किया जाना चाहिए।

परीक्षण के बाद स्वीकृति मानदंड बदलना

सत्यापन चलाने से पहले स्वीकृति मानदंड परिभाषित किया जाना चाहिए। परिणामों की समीक्षा करने के बाद उन्हें समायोजित करने से सत्यापन का बचाव करना कठिन हो सकता है।

सॉफ़्टवेयर और डेटाबेस संस्करणों को नियंत्रित करने में विफल होना

एचएलए एलील असाइनमेंट विश्लेषण नियमों और संदर्भ डेटा पर निर्भर करता है। सॉफ़्टवेयर और डेटाबेस संस्करणों को सत्यापन और नियमित परीक्षण के दौरान रिकॉर्ड और नियंत्रित किया जाना चाहिए।

प्रैक्टिकल एचएलए जीनोटाइपिंग परख सत्यापन चेकलिस्ट

दायरा

• ☐ इच्छित उपयोग प्रलेखित है।

• ☐ लक्ष्य लोकी सूचीबद्ध हैं।

• ☐ आवश्यक एलील रिज़ॉल्यूशन परिभाषित किया गया है।

• ☐ नमूना और डीएनए इनपुट आवश्यकताओं का दस्तावेजीकरण किया गया है।

• ☐ रिपोर्ट करने योग्य और गैर-रिपोर्ट करने योग्य परिणाम परिभाषित किए गए हैं।

संदर्भ सामग्री

• ☐ संदर्भ जीनोटाइप निर्दिष्ट किया गया है।

• ☐ संदर्भ सामग्री लक्ष्य लोकी को कवर करती है।

• ☐ सत्यापन विधि प्रलेखित है।

• ☐ सामग्री प्रारूप वर्कफ़्लो के अनुकूल है।

• ☐ भंडारण और स्थिरता की जानकारी उपलब्ध है।

• ☐ कैटलॉग संख्या और लॉट संख्या दर्ज की जाती है।

नियंत्रण

• ☐ सकारात्मक जीनोटाइपिंग नियंत्रण शामिल है।

• ☐ नो-टेम्पलेट नियंत्रण परिभाषित है।

• ☐ जब निष्कर्षण वर्कफ़्लो का हिस्सा होता है तो निष्कर्षण रिक्त को शामिल किया जाता है।

• ☐ आंतरिक प्रवर्धन या प्रक्रिया नियंत्रण का मूल्यांकन किया जाता है।

• ☐ नियंत्रण विफलता नियम प्रलेखित हैं।

विश्लेषणात्मक प्रदर्शन

• ☐ सटीकता का मूल्यांकन किया जाता है।

• ☐ पुनरावर्तनीयता का मूल्यांकन किया जाता है।

• ☐ प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता का मूल्यांकन किया जाता है।

• ☐ विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता या न्यूनतम डीएनए इनपुट को परिभाषित किया गया है।

• ☐ विश्लेषणात्मक विशिष्टता का मूल्यांकन किया जाता है।

• ☐ रिपोर्ट करने योग्य सीमा प्रलेखित है।

• ☐ अमान्य और नो-कॉल दरें मापी जाती हैं।

• ☐ मजबूती का आकलन किया जाता है।

प्रलेखन

• ☐ कच्चा डेटा बरकरार रखा जाता है।

• ☐ सॉफ़्टवेयर और डेटाबेस संस्करण रिकॉर्ड किए जाते हैं।

• ☐ विचलन की जांच की जाती है।

• ☐ स्वीकृति मानदंड लगातार लागू किए जाते हैं।

• ☐ अंतिम सत्यापन निष्कर्ष स्वीकृत हैं।

• ☐ पुनर्वैधीकरण ट्रिगर परिभाषित हैं।

निष्कर्ष

एक विश्वसनीय एचएलए जीनोटाइपिंग परख के लिए एक सफल प्रवर्धन या अनुक्रमण रन से कहीं अधिक की आवश्यकता होती है। प्रयोगशाला को यह प्रदर्शित करना होगा कि संपूर्ण वर्कफ़्लो स्पष्ट रूप से परिभाषित विश्लेषणात्मक दायरे के भीतर सटीक, सुसंगत और व्याख्या योग्य परिणाम उत्पन्न कर सकता है।

सबसे महत्वपूर्ण सत्यापन चरण आवश्यक लोकी और रिज़ॉल्यूशन को परिभाषित करना, उपयुक्त संदर्भ सामग्री का चयन करना, नियंत्रण नियम स्थापित करना, विश्लेषणात्मक प्रदर्शन का मूल्यांकन करना और पूर्वनिर्धारित स्वीकृति मानदंडों के विरुद्ध सभी परिणामों का दस्तावेजीकरण करना है। एकल-लोकस मानक केंद्रित एचएलए-बी परख के लिए उपयुक्त हो सकते हैं, जबकि मल्टी-लोकस सामग्रियां व्यापक एचएलए मिलान वर्कफ़्लो का समर्थन कर सकती हैं।

सत्यापन के बाद, नियमित नियंत्रण, प्रवृत्ति निगरानी, ​​​​संस्करण नियंत्रण और परिवर्तन-प्रबंधन प्रक्रियाएं समय के साथ प्रदर्शन को बनाए रखने में मदद करती हैं। जब संदर्भ सामग्री और नियंत्रण को एक संरचित सत्यापन योजना में एकीकृत किया जाता है, तो प्रयोगशालाएं पहले सीमाओं की पहचान कर सकती हैं और एचएलए जीनोटाइपिंग परिणामों को अधिक सुसंगत, तुलनीय और रक्षात्मक बना सकती हैं।

पूछे जाने वाले प्रश्न

एचएलए जीनोटाइपिंग सत्यापन में सबसे महत्वपूर्ण नियंत्रण क्या है?

एक विशिष्ट सकारात्मक संदर्भ सामग्री आवश्यक है क्योंकि यह तुलना के लिए एक निर्दिष्ट जीनोटाइप प्रदान करती है। हालाँकि, संदूषण या वर्कफ़्लो विफलताओं की पहचान करने के लिए नो-टेम्पलेट, निष्कर्षण और प्रक्रिया नियंत्रण की भी आवश्यकता हो सकती है।

क्या एक एचएलए संदर्भ मानक मल्टी-लोकस परख को मान्य कर सकता है?

हमेशा नहीं। मानक में उस लोकी और रिज़ॉल्यूशन को शामिल किया जाना चाहिए जिसे परख रिपोर्ट करने का दावा करता है। एक एकल-लोकस मानक केंद्रित सत्यापन का समर्थन कर सकता है लेकिन व्यापक मल्टी-लोकस वर्कफ़्लो के लिए पर्याप्त सबूत प्रदान नहीं कर सकता है।

एचएलए जीनोटाइपिंग के लिए विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता का मूल्यांकन कैसे किया जाता है?

इसका मूल्यांकन आमतौर पर विभिन्न डीएनए इनपुट स्तरों और गुणवत्ता स्थितियों का परीक्षण करके किया जाता है। प्रयोगशाला को सबसे कम इनपुट निर्धारित करना चाहिए जो अभी भी वैध प्रवर्धन, अनुक्रमण, एलील असाइनमेंट और रिपोर्टिंग उत्पन्न करता है।

नियंत्रण विफल होने पर क्या होना चाहिए?

रन को रोक दिया जाना चाहिए, कारण की जांच की जानी चाहिए, और समस्या का समाधान होने तक प्रभावित नमूनों की रिपोर्ट नहीं की जानी चाहिए। बार-बार परीक्षण और सुधारात्मक कार्रवाइयों का दस्तावेजीकरण किया जाना चाहिए।

क्या उच्च-रिज़ॉल्यूशन संदर्भ सामग्री स्वचालित रूप से उच्च-रिज़ॉल्यूशन रिपोर्टिंग को मान्य करती है?

नहीं, परख में रिपोर्ट किए गए एलील पदनाम को अलग करने के लिए आवश्यक अनुक्रम क्षेत्रों और विश्लेषणात्मक विशेषताओं को शामिल किया जाना चाहिए। एक विस्तृत संदर्भ परिणाम अपूर्ण परख कवरेज की भरपाई नहीं कर सकता है।

एचएलए परख को कब पुनः मान्य किया जाना चाहिए?

प्राइमर, लक्ष्य लोकी, अनुक्रमण रसायन विज्ञान, उपकरण, निष्कर्षण प्रक्रियाओं, सॉफ्टवेयर, एलील डेटाबेस, रिपोर्टिंग रिज़ॉल्यूशन, या अन्य स्थितियों में परिवर्तन के बाद पुनर्वैधीकरण की आवश्यकता हो सकती है जो रिपोर्ट किए गए जीनोटाइप को प्रभावित कर सकते हैं।