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Vistas: 0 Autor: Editor del sitio Hora de publicación: 2026-08-18 Origen: Sitio
Los ensayos de genotipado HLA requieren una validación cuidadosa porque el sistema HLA contiene una gran cantidad de alelos altamente polimórficos. Un resultado confiable depende no sólo de cebadores, sondas, química de secuenciación o software de análisis, sino también de la idoneidad de los materiales de referencia, el diseño de los controles y la forma en que se mide el rendimiento analítico.
Un plan de validación debe demostrar que el ensayo puede identificar correctamente los loci HLA previstos y la resolución de alelos en condiciones operativas definidas. También debe mostrar cómo funciona el método cuando cambian la entrada de ADN, los operadores, los lotes de reactivos, los instrumentos o los días de prueba.
Esta lista de verificación proporciona un marco práctico para validar un ensayo de genotipado HLA. Se centra en materiales de referencia, controles positivos y negativos, exactitud, precisión, sensibilidad analítica, especificidad analítica, rango notificable, resultados no válidos y monitoreo continuo de la calidad.
Antes de utilizar esta lista de verificación, Los estándares de referencia de HLA para la validación de ensayos y el control de calidad pueden proporcionar antecedentes adicionales sobre el papel de los materiales caracterizados en la evaluación del flujo de trabajo de HLA.
Defina el uso previsto, los loci objetivo, la resolución de alelos, el tipo de muestra y el formato de informe antes de que comience la validación.
Seleccione materiales de referencia que coincidan con los loci objetivo del ensayo, la resolución del genotipo, el formato de la muestra y el flujo de trabajo de la prueba.
Utilice controles positivos, negativos, de extracción, amplificación y contaminación cuando corresponda.
Evalúe la precisión, repetibilidad, reproducibilidad, sensibilidad analítica, especificidad, solidez y tasas de resultados no válidos.
Establezca criterios de aceptación antes de realizar las pruebas en lugar de ajustarlos después de que los resultados estén disponibles.
Registre datos sin procesar, desviaciones, versiones de software, reglas de interpretación y aprobación final.
Continúe utilizando controles adecuados después de la validación para monitorear el rendimiento del ensayo de rutina.
La validación del ensayo HLA debe proporcionar evidencia documentada de que el método es adecuado para el propósito previsto. El objetivo no es demostrar que un ensayo pueda identificar todos los alelos HLA que existen. Debido a que la diversidad de HLA es extensa, el laboratorio debe definir un alcance analítico realista y respaldar ese alcance con evidencia adecuada.
La validación debe responder a varias preguntas prácticas:
¿Puede el ensayo identificar correctamente los loci objetivo?
¿Puede distinguir los grupos de alelos requeridos o las designaciones a nivel de alelo?
¿Produce resultados consistentes cuando se repiten las pruebas?
¿Sigue siendo confiable con diferentes operadores, días, lotes de reactivos o instrumentos?
¿Cuál es la entrada mínima de ADN aceptable?
¿Cómo se manejan los resultados ambiguos o sin llamadas?
¿Qué resultados se consideran válidos, inválidos o fuera del rango reportable?
¿Qué controles deben pasar antes de aceptar una ejecución?
La validación debe cubrir todo el flujo de trabajo que se utilizará en la práctica. Si el proceso de rutina incluye extracción, amplificación, secuenciación, análisis de datos y presentación de informes de ADN, la validación no debe evaluar solo el paso final de secuenciación.
La primera parte de la lista de verificación es definir exactamente para qué está diseñado el ensayo.
El uso previsto puede incluir:
Investigación HLA de locus único
Genotipado multilocus
Investigación de emparejamiento entre donantes y receptores
Desarrollo de ensayos farmacogenómicos.
Evaluación del kit HLA
Comparación de métodos
Control de calidad de laboratorio de rutina.
Investigación que involucra la variación de la población HLA.
El uso previsto determina la cantidad de evidencia requerida. Un ensayo enfocado diseñado para identificar un alelo HLA-B no requiere el mismo alcance de validación que un ensayo de múltiples locus destinado a informar varios loci de clase I y clase II.
Documente cada locus incluido en el ensayo, como por ejemplo:
HLA-A
HLA-B
HLA-C
HLA-DRB1
HLA-DQB1
HLA-DPB1
HLA-DQA1
HLA-DPA1
HLA-DRB3, HLA-DRB4 y HLA-DRB5
No describa un ensayo como 'multilocus' sin enumerar los loci reales cubiertos. El material de referencia debe contener resultados asignados para los mismos loci que se espera que informe el ensayo.
Defina si el ensayo informa:
Resultados a nivel de antígeno
Resultados del grupo de alelos
Designaciones de alelos de dos campos
Designaciones de alelos de tres campos
Designaciones de alelos de cuatro campos
Un resultado definido por secuencia de mayor resolución
Un grupo de alelos ambiguo
El laboratorio también debe especificar si el ensayo informa un genotipo, dos alelos posibles o una lista de combinaciones de alelos no resueltos.
El plan de validación debe identificar el tipo de muestra utilizada en el flujo de trabajo de rutina, como ADN genómico o un material basado en células humanas. Los factores importantes incluyen:
concentración de ADN
pureza del ADN
integridad del ADN
Método de extracción
Condiciones de almacenamiento
Historia de congelación y descongelación
Volumen de muestra
Posibles inhibidores
Un estándar de referencia agregado directamente a una reacción de PCR puede evaluar la amplificación, la secuenciación y la interpretación, pero no necesariamente evalúa el proceso de extracción de ADN.
Los materiales de referencia proporcionan genotipos asignados con los que se pueden comparar los resultados de los ensayos. Su valor depende de qué tan bien coincidan con el alcance analítico del ensayo.
CB-Gene proporciona un Categoría de producto estándar de referencia de HLA que cubre materiales de genotipado de HLA de locus único y multilocus.
Para un ensayo enfocado, el material de referencia debe contener el locus objetivo específico y la designación del alelo requerido para la evaluación.
CB-Gen Los estándares HLA de locus único cubren principalmente la tipificación HLA-B. La información del producto incluye los estándares de referencia HLA-B 27:04, HLA-B 27:05, HLA-B 57:01, HLA-B 15:02, HLA-B 58:01, HLA-B 13:01 y HLA-B*27:07.
El El estándar de genotipado de locus único HLA se proporciona como ADN genómico y está destinado a uso en investigación. Su método de verificación listado es la secuenciación PCR-SBT/Sanger.
Para un flujo de trabajo de coincidencia amplio, un material de referencia multilocus puede ser más apropiado. CB-Gen Los estándares de locus múltiples de coincidencia de HLA cubren un amplio grupo de loci de HLA, incluidos HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/3/4/5, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 y HLA-DQB1.
Antes de realizar la prueba, registre:
Designación de alelo asignado
Lugares objetivo
Nivel de resolución
Método de verificación
Formato de materiales
Número de catálogo o número de lote
Certificado o datos técnicos
Condiciones de almacenamiento
Información de vencimiento
El valor asignado debe ser lo suficientemente detallado como para respaldar la comparación prevista. Si un ensayo informa un resultado de dos campos, un estándar con sólo una designación de grupo de alelos puede no ser suficiente. De manera similar, un resultado de referencia de alta resolución no puede probar el rendimiento del ensayo en regiones de secuencia que el ensayo no examina.
El material de referencia debe ser compatible con el flujo de trabajo seleccionado. Las preguntas relevantes incluyen:
¿El material es ADN genómico?
¿Se puede utilizar en flujos de trabajo PCR-SBT o Sanger?
¿Es adecuado para NGS específicos?
¿Es adecuado para secuenciación de lectura larga?
¿Ingresa al flujo de trabajo antes o después de la extracción de ADN?
¿El material reproduce el fondo de muestra esperado?
¿El genotipo asignado está respaldado por un método de verificación apropiado?
CB-Gene afirma que sus productos de referencia HLA han sido evaluados mediante secuenciación Sanger, PCR-SBT o secuenciación de tercera generación, con confirmación del genotipo mediante alineación de secuencias con secuencias de referencia HLA. Esta información debe compararse con el método que se está validando.
Artículo |
Controlar |
|---|---|
Los loci objetivo coinciden con el ensayo |
☐ |
El genotipo asignado está disponible. |
☐ |
La resolución coincide con el resultado notificable |
☐ |
El método de verificación está documentado. |
☐ |
El formato del material es compatible. |
☐ |
La información de almacenamiento y estabilidad está disponible. |
☐ |
Se registra la información del catálogo y del lote. |
☐ |
El certificado o los datos técnicos están archivados. |
☐ |
Se deben colocar controles en las etapas donde pueden ocurrir fallas. Un único control positivo al final del flujo de trabajo no puede identificar todas las posibles fuentes de error.
Un control positivo debe contener un genotipo HLA conocido que el ensayo está diseñado para detectar. Se puede utilizar para verificar:
amplificación de ADN
Rendimiento del cebador o sonda
Calidad de secuenciación
Asignación de alelos
Interpretación de software
Formato de informe
Para un ensayo de locus único, uno o más estándares específicos de alelo pueden ser suficientes para la evaluación inicial. Para un ensayo de múltiples locus, un control que cubra varios loci objetivo puede proporcionar una mejor evidencia del rendimiento del flujo de trabajo integrado.
Un control negativo o no objetivo puede ayudar a evaluar si el ensayo produce un resultado positivo inapropiado para un objetivo definido. Su idoneidad depende del diseño del ensayo.
Por ejemplo, un ensayo de PCR-SSP dirigido puede requerir muestras que carezcan de la secuencia objetivo. En cambio, un ensayo basado en secuenciación puede depender más de controles de contaminación y materiales de discriminación de alelos.
Por lo tanto, el término 'control negativo' debería definirse claramente en el protocolo. No se debe suponer que una muestra genérica negativa pueda evaluar todos los aspectos de la especificidad del genotipado HLA.
Un control sin plantilla no contiene plantilla de ADN agregada. Se utiliza para controlar la contaminación introducida durante la preparación o amplificación de la reacción.
Si el control sin plantilla produce una señal de amplificación o un resultado de secuencia inesperado, se debe investigar la serie antes de publicar los resultados de cualquier paciente o muestra de investigación.
Un blanco de extracción pasa por el proceso de extracción de ADN sin muestra biológica. Ayuda a identificar la contaminación introducida durante:
Preparación de muestras
Reactivos de extracción
Equipo de extracción
Superficies de trabajo
Pasos de transferencia
Si el estándar HLA se agrega solo después de la extracción, no puede evaluar la contaminación o la recuperación durante la etapa de extracción.
Cuando el diseño del ensayo lo respalda, un control interno puede ayudar a identificar:
inhibición de la PCR
Fallo de reacción
ADN insuficiente
Preparación incorrecta del reactivo
Poca eficiencia de amplificación
El control debería tener criterios de aceptación definidos. Un control que está presente pero no se interpreta de manera consistente no proporciona evidencia de calidad significativa.
El protocolo de validación debe indicar:
¿Qué controles deben pasar?
¿Qué calidad de señal o secuencia es aceptable?
Cómo afectan los controles fallidos a la ejecución
Si un control fallido requiere repetir la prueba
¿Quién está autorizado a aprobar o rechazar una ejecución?
Cómo se documentan las fallas de control
La sección de rendimiento analítico debe diseñarse en torno al resultado real del ensayo HLA.
La precisión es la concordancia entre el resultado del ensayo y el resultado de referencia asignado o aceptado.
La evaluación de la precisión puede incluir:
Pruebas de materiales de referencia HLA caracterizados
Comparar resultados con un método establecido
Comparar resultados a la misma resolución
Confirmar resultados discordantes utilizando un método apropiado
Evaluación de grupos de alelos representativos.
Revisar el informe final en lugar de solo datos de secuencia sin procesar
La comparación debe distinguir entre un verdadero desacuerdo sobre el genotipo y una diferencia causada por el formato de la nomenclatura, la versión de la base de datos o la resolución de los informes.
Por ejemplo, dos resultados pueden parecer diferentes porque uno usa un formato de alelo heredado mientras que el otro usa un formato basado en dos puntos. Estas diferencias deberían normalizarse antes de clasificar un resultado como discordante.
La repetibilidad evalúa el rendimiento bajo las mismas condiciones operativas. Considere repetir el ensayo usando:
el mismo operador
el mismo instrumento
El mismo lote de reactivos
el mismo laboratorio
El mismo día de prueba o intervalo de prueba corto
La repetibilidad debe evaluar tanto la asignación correcta de alelos como las métricas de calidad utilizadas para determinar si un resultado es válido.
La reproducibilidad evalúa el rendimiento cuando cambian las condiciones normales de funcionamiento. Dependiendo del laboratorio, esto puede incluir:
Diferentes operadores
Diferentes días de prueba
Diferentes lotes de reactivos
Diferentes instrumentos
Diferentes lotes de preparación de ADN.
Diferentes sesiones de análisis.
El objetivo es determinar si el ensayo produce resultados consistentes más allá de una única ejecución ideal.
Para un ensayo de genotipado HLA cualitativo, la sensibilidad analítica generalmente se relaciona con la cantidad y calidad mínimas de ADN que pueden producir un resultado válido y correctamente asignado.
La validación debe evaluar:
Entrada mínima de ADN
rango de concentración de ADN
rango de pureza del ADN
ADN degradado, si es relevante
Muestras de bajo insumo
Detección de alelos heterocigotos
Riesgo de abandono de alelos
Tarifas no válidas o sin llamadas en niveles de entrada más bajos
El laboratorio debe definir una entrada mínima aceptable en lugar de asumir que cualquier concentración de ADN mensurable es adecuada.
Si el ensayo está diseñado para una aplicación específica de baja abundancia o de muestras mixtas, la validación debe definir por separado cómo se evalúa la detección de alelos menores. Los criterios de aceptación deben reflejar el uso real previsto.
La especificidad analítica describe la capacidad del ensayo para distinguir el genotipo HLA deseado de secuencias relacionadas o no objetivo.
La evaluación debe considerar:
Grupos de alelos estrechamente relacionados
Alelos con regiones de unión a cebadores similares
Posibles secuencias de reacción cruzada.
Amplificación no específica
Asignación de alelos incorrecta causada por una cobertura incompleta
Interferencia del ADN no objetivo
Contaminación entre muestras.
Debido a que el sistema HLA es altamente polimórfico, la especificidad no debe demostrarse con una sola muestra positiva y una negativa. El panel de pruebas debe incluir genotipos desafiantes representativos siempre que sean relevantes para el objetivo del ensayo.
El rango reportable debe definir:
Lugares que pueden ser reportados
Grupos de alelos que se pueden distinguir.
Resolución máxima reportable
Regiones de secuencia cubiertas
Resultados ambiguos aceptables
Condiciones que requieren una no llamada
Resultados que requieren pruebas complementarias
Un ensayo no debe informar una designación de alelo más detallada de lo que respalda la evidencia validada. Una profundidad de lectura alta o una señal de amplificación fuerte no compensan la falta de regiones objetivo o la información de fase no resuelta.
La validación debe establecer con qué frecuencia el ensayo produce:
Resultados no válidos
Resultados sin llamadas
Resultados ambiguos
amplificación fallida
Secuenciación fallida
Cobertura insuficiente
Asignaciones de alelos no resueltas
El laboratorio debe definir criterios de aceptación separados para fallas técnicas y ambigüedad biológica. Una no llamada causada por una cobertura de secuencia inadecuada es diferente de un resultado ambiguo causado por dos alelos que comparten la misma secuencia probada.
La robustez evalúa si cambios pequeños y realistas en las condiciones operativas afectan el resultado. Las variables potenciales incluyen:
concentración de ADN
Variación de pipeteo
Temperatura de recocido
tiempo de reacción
Lote de reactivos
Duración del almacenamiento
Número de ciclos de congelación-descongelación
Calidad de ejecución de secuenciación
Umbral de análisis
Versión de software
Sólo se deben cuestionar las variables relevantes. El propósito es identificar condiciones que pueden ocurrir durante la operación de rutina y determinar si podrían cambiar el genotipo reportado.
Artículo de rendimiento |
Pregunta principal |
Evidencia típica |
|---|---|---|
Exactitud |
¿El resultado concuerda con el genotipo asignado? |
Materiales de referencia caracterizados y comparación de métodos. |
Repetibilidad |
¿El ensayo da el mismo resultado en condiciones sin cambios? |
Replicar pruebas realizadas por el mismo operador |
Reproducibilidad |
¿El desempeño sigue siendo consistente en todas las variables normales? |
Diferentes días, operadores, lotes o instrumentos |
Sensibilidad analítica |
¿Cuál es el aporte y la calidad mínima aceptable de ADN? |
Estudios de dilución o de bajos insumos |
Especificidad analítica |
¿Puede el ensayo distinguir secuencias objetivo y secuencias no objetivo relacionadas? |
Alelos desafiantes y muestras no objetivo |
Rango reportable |
¿Qué loci y resoluciones de alelos se pueden informar? |
Cobertura definida y evaluación de interpretación. |
Robustez |
¿Pueden los cambios menores en el proceso afectar el resultado? |
Estudios de variación controlada |
Tarifa no válida |
¿Con qué frecuencia el ensayo no genera un resultado válido? |
Pruebas repetidas en todo el panel de validación |
Se debe planificar una ejecución de validación antes de analizar las muestras. El protocolo debe definir:
Número y tipo de materiales de referencia.
Número de réplicas
Colocación de controles
Operadores involucrados
Días de prueba
Lotes de reactivos
Instrumentos
Aleatorización de muestras
Procedimiento de análisis de datos
Criterios de aceptación
Reglas para repetir la prueba.
Las réplicas deben ser suficientes para evaluar la afirmación de desempeño que se realiza. Una pequeña cantidad de pruebas repetidas puede demostrar una viabilidad básica, pero es posible que no respalde las afirmaciones sobre la reproducibilidad entre operadores, instrumentos o lotes de reactivos.
La validación también debe incluir condiciones de falla representativas cuando corresponda. Por ejemplo, se puede evaluar deliberadamente una entrada baja de ADN, una amplificación insuficiente o una calidad deficiente de la secuencia para confirmar cómo el ensayo maneja los resultados no válidos.
Antes de revisar los datos, defina cómo se clasificarán los resultados.
El resultado observado coincide con el resultado asignado en la resolución de informe validada.
El resultado observado utiliza una convención de formato diferente pero representa la misma designación de alelo. Esto puede incluir formatos de nomenclatura heredados y basados en dos puntos.
El resultado observado concuerda con una resolución más baja pero no respalda la designación asignada completa. Esto no debe considerarse un acuerdo total cuando el ensayo afirma generar informes de mayor resolución.
El resultado observado entra en conflicto con el genotipo asignado después de excluir las diferencias de nomenclatura y resolución.
El ensayo no genera un resultado reportable debido a controles fallidos, ADN insuficiente, amplificación deficiente, calidad de secuencia inadecuada o análisis no resueltos.
Todas las reglas de comparación deben documentarse en el plan de validación. El laboratorio debe evitar cambiar los criterios de clasificación después de ver los resultados.
Un archivo de validación completo debe incluir:
Protocolo de validación
Declaración de uso previsto
Versión de ensayo
Información sobre cebadores, sondas, kits y reactivos
Información del instrumento
Versiones de software y bases de datos.
Certificados de material de referencia
Configuración de controles
Datos brutos del instrumento
Archivos de secuencia o amplificación
Informes de análisis
Tablas de comparación de resultados
Desviaciones e investigaciones
Registros de ejecución fallida
Acciones correctivas
Resumen final del desempeño
Firmas y fechas de aprobación
El informe final debe indicar claramente si el ensayo cumple con los criterios de aceptación predefinidos. Si persiste una limitación, se debe describir en la sección de rango reportable o de interpretación.
La validación no está completa cuando el laboratorio obtiene un conjunto de resultados correctos. Está completo cuando el método, los controles, las limitaciones, las reglas de análisis y las condiciones de operación están documentados y aprobados.
Después de la validación, el laboratorio debe continuar monitoreando el ensayo.
El control de calidad de rutina puede incluir:
Pruebas de control positivo
Pruebas de control sin plantilla
Prueba de extracción en blanco
Revisión de tendencias de control
Verificación del lote de reactivos
Pruebas periódicas del material de referencia.
Revisión de tarifas no válidas y sin llamadas
Control de versiones de software y bases de datos.
Investigación de patrones de alelos inesperados.
Documentación de acciones correctivas.
Se debe utilizar un control con una frecuencia adecuada al riesgo del ensayo y al volumen de prueba. El laboratorio debe definir cuándo un nuevo lote de reactivo, instrumento, versión de software, diseño de cebador o algoritmo de interpretación requiere una revalidación parcial o completa.
Los posibles desencadenantes de la revalidación incluyen:
Cambio en los loci objetivo
Cambio en la resolución de informes
Nuevo diseño de cebador o sonda.
Nueva química de secuenciación
Nueva plataforma de instrumentos
Actualización de software importante
Nueva versión de la base de datos HLA
Cambio en el método de extracción.
Fallo de control significativo
Aumento repetido de resultados sin llamadas
Los materiales HLA de CB-Gene se pueden seleccionar según el alcance del ensayo que se esté desarrollando.
Para flujos de trabajo HLA-B enfocados o de locus único, el El estándar de genotipado de locus único HLA proporciona materiales de ADN genómico caracterizados con asignaciones de alelos enumerados e información de verificación PCR-SBT/Sanger.
Para flujos de trabajo de coincidencia de HLA más amplios, el El estándar de genotipado de múltiples locus de coincidencia de HLA incluye múltiples loci de HLA y figura como verificado mediante secuenciación de tercera generación. La información del producto también describe la confirmación del genotipo basada en secuencia utilizando la alineación de la base de datos HLA.
Estos materiales pueden respaldar estudios de precisión, comparación de métodos, capacitación de operadores, evaluación de repetibilidad y control de calidad de rutina. Aún así, el laboratorio debe confirmar que el material seleccionado coincide con sus propios loci objetivo, resolución, formato de muestra y uso previsto.
Una muestra positiva puede mostrar que el ensayo puede detectar un genotipo, pero no demuestra una discriminación amplia de alelos ni un rendimiento de múltiples locus.
Un control asignado únicamente a nivel de grupo de alelos no puede validar completamente una afirmación de informe de dos o tres campos.
Un estándar de ADN genómico purificado agregado después de la extracción no puede demostrar la recuperación de la extracción ni el control de la contaminación en la etapa de extracción.
La alta cobertura no resuelve las variantes fuera de la región de destino. Tampoco resuelve automáticamente la ambigüedad de fase o la interpretación incorrecta de la base de datos de referencia.
Los resultados no válidos y ambiguos son parte del rendimiento del ensayo. Deben medirse, investigarse e incluirse en el informe de validación.
Los criterios de aceptación deben definirse antes de la ejecución de la validación. Ajustarlos después de revisar los resultados puede hacer que la validación sea difícil de defender.
La asignación de alelos HLA depende de las reglas de análisis y los datos de referencia. Las versiones del software y de la base de datos deben registrarse y controlarse durante la validación y las pruebas de rutina.
☐ El uso previsto está documentado.
☐ Se enumeran los lugares objetivo.
☐ Se define la resolución alélica requerida.
☐ Los requisitos de entrada de muestras y ADN están documentados.
☐ Se definen los resultados reportables y no reportables.
☐ Se asigna el genotipo de referencia.
☐ El material de referencia cubre los loci objetivo.
☐ El método de verificación está documentado.
☐ El formato del material es compatible con el flujo de trabajo.
☐ La información sobre almacenamiento y estabilidad está disponible.
☐ Se registran el número de catálogo y el número de lote.
☐ Se incluye control de genotipado positivo.
☐ Se define control sin plantilla.
☐ El blanco de extracción se incluye cuando la extracción es parte del flujo de trabajo.
☐ Se evalúa la amplificación interna o el control del proceso.
☐ Las reglas de fallas de control están documentadas.
☐ Se evalúa la precisión.
☐ Se evalúa la repetibilidad.
☐ Se evalúa la reproducibilidad.
☐ Se define la sensibilidad analítica o entrada mínima de ADN.
☐ Se evalúa la especificidad analítica.
☐ El rango reportable está documentado.
☐ Se miden las tarifas de llamadas no válidas y sin llamadas.
☐ Se evalúa la robustez.
☐ Se conservan los datos brutos.
☐ Se registran las versiones del software y de la base de datos.
☐ Se investigan las desviaciones.
☐ Los criterios de aceptación se aplican consistentemente.
☐ Se aprueban las conclusiones finales de la validación.
☐ Se definen los factores desencadenantes de la revalidación.
Un ensayo de genotipado HLA confiable requiere más que una amplificación o secuenciación exitosa. El laboratorio debe demostrar que el flujo de trabajo completo puede producir resultados precisos, consistentes e interpretables dentro de un alcance analítico claramente definido.
Los pasos de validación más importantes son definir los loci y la resolución requeridos, seleccionar materiales de referencia adecuados, establecer reglas de control, evaluar el rendimiento analítico y documentar todos los resultados según criterios de aceptación predefinidos. Los estándares de locus único pueden ser apropiados para ensayos de HLA-B enfocados, mientras que los materiales de locus múltiples pueden admitir flujos de trabajo de coincidencia de HLA más amplios.
Después de la validación, los controles de rutina, el seguimiento de tendencias, el control de versiones y los procedimientos de gestión de cambios ayudan a mantener el rendimiento a lo largo del tiempo. Cuando los materiales de referencia y los controles se integran en un plan de validación estructurado, los laboratorios pueden identificar las limitaciones antes y hacer que los resultados del genotipado HLA sean más consistentes, comparables y defendibles.
Un material de referencia positivo caracterizado es esencial porque proporciona un genotipo asignado para comparar. Sin embargo, también pueden ser necesarios controles sin plantilla, de extracción y de proceso para identificar contaminación o fallas en el flujo de trabajo.
No siempre. El estándar debe cubrir los loci y la resolución que el ensayo pretende informar. Un estándar de locus único puede respaldar una validación enfocada, pero puede no proporcionar evidencia suficiente para un flujo de trabajo amplio de múltiples locus.
Comúnmente se evalúa probando diferentes niveles de entrada de ADN y condiciones de calidad. El laboratorio debe determinar la entrada más baja que todavía produce amplificación, secuenciación, asignación de alelos e informes válidos.
La ejecución se debe suspender, se debe investigar la causa y no se deben informar las muestras afectadas hasta que se resuelva el problema. Se deben documentar las pruebas repetidas y las acciones correctivas.
No. El ensayo debe cubrir las regiones de secuencia y las características analíticas necesarias para distinguir la designación del alelo informado. Un resultado de referencia detallado no puede compensar una cobertura incompleta del ensayo.
Es posible que se requiera una revalidación después de cambios en los cebadores, los loci objetivo, la química de secuenciación, los instrumentos, los procedimientos de extracción, el software, las bases de datos de alelos, la resolución de informes u otras condiciones que puedan afectar el genotipo informado.
