Comparaison des méthodes de test MSI : IHC, PCR-CE et NGS pour la détection de l'instabilité des microsatellites

L'instabilité des microsatellites, communément appelée MSI, est un biomarqueur moléculaire important en oncologie. Il est étroitement associé à des défauts du système de réparation des mésappariements d’ADN, également connu sous le nom de dMMR. Le statut MSI est largement utilisé dans le diagnostic du cancer, le dépistage du syndrome de Lynch, l'évaluation du pronostic et la prise de décision en matière de traitement.

Alors que les tests MSI deviennent de plus en plus importants en pathologie moléculaire et en oncologie de précision, les laboratoires doivent comprendre les différences entre les méthodes de test disponibles. Les approches les plus couramment utilisées comprennent l’immunohistochimie, la PCR combinée à l’électrophorèse capillaire et le séquençage de nouvelle génération.

Chaque méthode a ses propres avantages, limites et scénarios d’application idéaux. Cet article compare IHC, PCR-CE et NGS pour la détection des MSI et explique pourquoi les étalons de référence MSI validés sont essentiels pour le développement de tests fiables et le contrôle qualité.

Pourquoi les tests MSI sont importants

Le MSI se produit lorsque de courtes séquences d’ADN répétitives, appelées microsatellites, deviennent instables en raison d’erreurs d’insertion ou de suppression lors de la réplication de l’ADN. Dans les cellules normales, ces erreurs sont corrigées par le système de réparation des mésappariements. Lorsque la fonction de réparation des mésappariements est défectueuse, des erreurs peuvent s’accumuler, entraînant des modifications de la longueur des microsatellites.

Les tests MSI sont importants car le statut MSI/dMMR peut fournir des informations précieuses pour :

• Dépistage du syndrome de Lynch

• Caractériser la biologie des tumeurs

• Soutenir l’évaluation du pronostic

• Guider les décisions liées au traitement

• Développer et valider des tests de diagnostic moléculaire

• Soutenir la recherche en oncologie et les études sur les biomarqueurs

Étant donné que le statut MSI peut influencer l’interprétation clinique et de recherche, le flux de travail des tests doit être précis, reproductible et bien validé.

Principales méthodes de test MSI

Les trois principales approches utilisées pour l’évaluation MSI ou dMMR sont :

1. Immunohistochimie, ou IHC

2. Tests MSI basés sur PCR, en particulier PCR-CE

3. Séquençage de nouvelle génération, ou NGS

Bien que ces méthodes soient liées, elles ne mesurent pas exactement la même chose. IHC évalue l'expression des protéines de réparation des mésappariements, tandis que PCR-CE et NGS évaluent directement ou par ordinateur l'instabilité des microsatellites au niveau de la séquence d'ADN.

IHC pour l'expression des protéines MMR

L'immunohistochimie est l'une des méthodes les plus largement utilisées pour évaluer le déficit de réparation des mésappariements. Au lieu de détecter directement les changements de longueur des microsatellites, l’IHC évalue l’expression des protéines MMR clés dans le tissu tumoral.

Les protéines couramment testées comprennent :

• MLH1

• MSH2

• MSH6

• PMS2

Si une ou plusieurs de ces protéines sont absentes, la tumeur peut être considérée comme déficiente en réparation des mésappariements. Le dMMR étant fortement associé au MSI-H, l’IHC est souvent utilisé comme méthode de dépistage pratique.

Avantages de l'IHC

L'IHC est largement disponible dans les laboratoires de pathologie et peut être intégré aux flux de travail de routine basés sur les tissus. Il fournit des informations visuelles sur l’expression des protéines et peut aider à identifier quelle protéine MMR pourrait être perdue.

Par exemple, la perte d’expression de MLH1 et PMS2 peut suggérer un schéma biologique différent de la perte isolée de MSH6. Cela rend l’IHC utile non seulement pour le dépistage, mais également pour guider des investigations plus approfondies.

Limites de l’IHC

IHC ne mesure pas directement l’instabilité des microsatellites. Il évalue uniquement l’expression des protéines. Dans certains cas, l’expression des protéines peut être conservée même en présence de défauts fonctionnels. L'interprétation peut également être affectée par la qualité des tissus, les conditions de coloration, la fixation, la performance des anticorps et l'expérience du pathologiste.

Par conséquent, l’IHC est utile mais peut devoir être appuyée par des tests moléculaires dans certaines situations.

PCR-CE pour l'analyse des marqueurs microsatellites

La PCR-CE est une méthode moléculaire qui analyse directement des marqueurs microsatellites sélectionnés. Dans ce flux de travail, des régions microsatellites spécifiques sont amplifiées par PCR puis analysées par électrophorèse capillaire.

Le but est de détecter les changements dans la longueur des fragments. L’ADN tumoral est souvent comparé à l’ADN normal apparié pour déterminer si la taille des marqueurs microsatellites a changé. Si plusieurs marqueurs présentent une instabilité, l’échantillon peut être classé comme MSI-H.

Les marqueurs MSI courants comprennent les marqueurs mononucléotidiques tels que BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 et MONO-27. Certains systèmes peuvent également inclure des marqueurs supplémentaires tels que des marqueurs NR-27 ou pentanucléotidiques pour l'identification des échantillons et le contrôle qualité.

Avantages du PCR-CE

La PCR-CE est une méthode bien établie pour la détection des MSI. Il fournit des informations directes sur la taille des fragments pour des locus microsatellites sélectionnés et convient aux laboratoires qui ont besoin d'un flux de travail MSI ciblé et ciblé.

La PCR-CE peut être particulièrement utile lorsque les laboratoires souhaitent une méthode de test MSI dédiée plutôt qu’une approche large de profilage génomique.

Limites du PCR-CE

La PCR-CE analyse généralement un nombre limité de marqueurs. Ses performances dépendent du panel de marqueurs sélectionné, de la qualité de l’ADN, du contenu tumoral et des critères d’interprétation.

Une autre limite est que la PCR-CE peut nécessiter une correspondance d’ADN normal pour une comparaison plus précise, en fonction de la conception du test. Certains flux de travail peuvent être affectés par la qualité des échantillons ou par une faible fraction tumorale.

Malgré ces limitations, la PCR-CE reste une méthode importante pour les tests MSI en raison de sa nature ciblée et de ses résultats d’analyse de fragments clairs.

Détection MSI basée sur NGS

Le séquençage de nouvelle génération est devenu une approche de plus en plus importante pour la détection des MSI. NGS peut évaluer simultanément de nombreuses régions génomiques et peut souvent être intégré à des flux de travail plus larges de profilage de tumeurs.

Le statut MSI peut être déduit de :

• Panels de gènes ciblés

• Séquençage de l'exome entier

• Séquençage du génome entier

• Autres ensembles de données de profilage de tumeurs basées sur le séquençage

La détection MSI basée sur NGS repose généralement sur des algorithmes bioinformatiques qui analysent les régions microsatellites à travers les données de séquençage. Au lieu d’examiner seulement quelques marqueurs, NGS peut évaluer un plus grand nombre de loci en fonction de la conception du panel et du pipeline analytique.

Avantages du NGS

Le plus grand avantage du NGS est sa capacité à combiner la détection des MSI avec un profilage génomique plus large. Un seul flux de travail NGS peut potentiellement fournir des informations sur les mutations, les modifications du nombre de copies, la charge de mutation tumorale, les fusions de gènes et le statut MSI, en fonction de la conception du test.

Cela rend NGS attrayant pour les laboratoires qui effectuent déjà des tests génomiques complets sur le cancer.

NGS peut également offrir une analyse à haut débit et peut réduire le besoin de plusieurs tests distincts lorsqu'un flux de travail de séquençage validé est déjà en place.

Limites du NGS

La détection MSI basée sur NGS nécessite une validation minutieuse. Le résultat dépend non seulement des performances du laboratoire humide, mais également de la profondeur de séquençage, de la conception du panel, de la couverture des locus microsatellites, de la pureté de la tumeur, de la qualité de l'ADN et des algorithmes bioinformatiques.

Différents panneaux NGS peuvent ne pas fonctionner de la même manière pour la détection des MSI. Un panel conçu principalement pour la détection de mutations peut ne pas être automatiquement optimal pour les appels MSI à moins que les performances MSI n'aient été spécifiquement validées.

Par conséquent, des étalons de référence fiables sont particulièrement importants pour le développement de tests MSI basés sur NGS et la vérification des pipelines.

IHC vs PCR-CE vs NGS : différences clés

Comment choisir la bonne méthode de test MSI

Il n’existe pas de méthode de test MSI idéale pour chaque laboratoire ou chaque application. Le meilleur choix dépend de l’objectif du test, du type d’échantillon disponible, de l’infrastructure du laboratoire et des exigences de validation.

Quand l’IHC peut être préféré

L’IHC peut être préférable lorsqu’un laboratoire a besoin d’une méthode de criblage basée sur les tissus pour l’expression des protéines de réparation des mésappariements. Il est couramment utilisé dans les flux de travail en pathologie et peut fournir des informations utiles sur les protéines MMR perdues.

Quand le PCR-CE peut être préféré

La PCR-CE peut être préférée lorsqu’un laboratoire a besoin d’un test MSI moléculaire ciblé avec analyse directe de la taille des fragments. Il est utile pour les tests MSI dédiés et pour les laboratoires qui souhaitent un flux de travail ciblé basé sur des marqueurs microsatellites connus.

Quand NGS peut être préféré

Le NGS peut être préféré lorsque la détection des MSI fait partie d’un flux de travail plus large de profilage génomique du cancer. Il est particulièrement utile pour les laboratoires qui utilisent déjà des panels ciblés ou des tests de séquençage complets.

Cependant, la détection MSI basée sur NGS doit être validée avec des matériaux de référence appropriés pour garantir que le pipeline de tests et de bioinformatique peut classer avec précision les échantillons MSI-H et MSS.

Pourquoi les normes de référence MSI sont importantes sur toutes les plateformes

Quelle que soit la méthode utilisée, les tests MSI nécessitent une validation et un contrôle qualité fiables. Les normes de référence aident les laboratoires à confirmer que leurs tests peuvent détecter correctement le statut MSI connu.

Les normes de référence MSI peuvent prendre en charge :

• Développement de tests

• Validation analytique

• Évaluation de la limite de détection

• Tests de contrôle positifs et négatifs

• Études de reproductibilité inter-séries

• Comparaison des plateformes

• Formation des opérateurs

• Contrôle qualité courant

• Vérification du pipeline bioinformatique pour NGS

Pour la PCR-CE, les normes de référence peuvent aider à vérifier l’amplification des marqueurs, la taille des fragments et la classification MSI.

Pour NGS, les normes de référence peuvent aider à évaluer les performances de séquençage, la couverture des panels, les algorithmes d’appel MSI et la cohérence globale du flux de travail.

Pour les développeurs de DIV, les normes de référence peuvent prendre en charge le développement de produits et l’évaluation des performances dans différentes conceptions de tests.

Étalons de référence CB-Gene MSI pour les flux de travail PCR-CE et NGS

CB-Gene fournit Étalons de référence MSI conçus pour prendre en charge la validation des tests de diagnostic moléculaire et le contrôle qualité.

Le produit CB-Gene MSI Reference Standard comprend des échantillons d’ADN génomique appariés, y compris de l’ADN dérivé d’une tumeur et de l’ADN normal apparié ou de référence. L'ensemble de produits comprend à la fois des échantillons stables de microsatellites et des échantillons MSI-H, ce qui le rend utile pour évaluer si un test peut distinguer correctement le MSS du MSI-H.

Selon les informations sur le produit CB-Gene, les normes de référence sont confirmées par les tests PCR-CE et NGS. Le système d'analyse PCR-CE MSI comprend plusieurs marqueurs nucléotidiques tels que BAT-25, BAT-26, MONO-27, NR-21, NR-24 et NR-27 pour le typage MSI.

Cela rend les normes adaptées aux laboratoires développant, validant ou surveillant des flux de travail MSI basés sur des plateformes PCR-CE ou NGS.

Applications des normes de référence MSI

Les normes de référence CB-Gene MSI peuvent être utilisées dans plusieurs scénarios techniques et de développement.

Validation du test PCR-CE

Les laboratoires peuvent utiliser les normes MSI-H et MSS pour vérifier l'amplification PCR, les performances de l'électrophorèse capillaire, la stabilité des marqueurs et l'exactitude de la classification.

Validation du panneau NGS

Les laboratoires de séquençage peuvent utiliser des étalons de référence pour évaluer si leur panel NGS et leur pipeline d'analyse peuvent identifier correctement le statut MSI-H et MSS.

Vérification du pipeline bioinformatique

Pour la détection MSI basée sur NGS, le pipeline informatique est un élément essentiel du flux de travail de test. Les normes de référence avec un statut MSI confirmé peuvent aider à vérifier les algorithmes d’appel MSI et les seuils de classification.

Contrôle de qualité

Les étalons de référence peuvent être inclus dans les flux de travail de contrôle qualité de routine pour surveiller la cohérence des tests au fil du temps.

Développement de produits DIV

Les développeurs de tests diagnostiques peuvent utiliser les matériaux de référence MSI lors du développement, de l’optimisation et de l’évaluation des performances des kits.

Conclusion

IHC, PCR-CE et NGS sont toutes des méthodes importantes pour évaluer le déficit de réparation des MSI ou des mésappariements, mais elles diffèrent par ce qu'elles mesurent et la manière dont elles sont utilisées.

IHC évalue l'expression de la protéine MMR. PCR-CE analyse directement les changements de longueur des marqueurs microsatellites sélectionnés. NGS permet la détection des MSI dans le cadre de flux de travail plus larges de profilage génomique du cancer.

Étant donné que chaque méthode présente des atouts et des limites différents, les laboratoires doivent choisir le flux de travail approprié en fonction de leurs objectifs de test, de l'infrastructure disponible, du type d'échantillon et des besoins de validation.

Des étalons de référence MSI fiables sont essentiels pour renforcer la confiance dans les performances des tests. Les étalons de référence CB-Gene MSI fournissent des matériaux d'ADN génomique MSI-H et MSS confirmés pour la validation des tests MSI basés sur PCR-CE et NGS, aidant ainsi les laboratoires et les développeurs de diagnostics à améliorer la cohérence, la reproductibilité et la confiance dans les tests MSI.

Pour plus d’informations sur les étalons de référence CB-Gene MSI, veuillez contacter CB-Gene pour plus de détails sur le produit, les spécifications techniques et l’assistance aux applications.