Métodos de prueba de MSI comparados: IHC, PCR-CE y NGS para detectar la inestabilidad de microsatélites

La inestabilidad de microsatélites, comúnmente conocida como MSI, es un biomarcador molecular importante en oncología. Está estrechamente asociado con defectos en el sistema de reparación de errores de coincidencia del ADN, también conocido como dMMR. El estado de MSI se utiliza ampliamente en el diagnóstico del cáncer, la detección del síndrome de Lynch, la evaluación del pronóstico y la toma de decisiones sobre el tratamiento.

A medida que las pruebas MSI se vuelven cada vez más importantes en patología molecular y oncología de precisión, los laboratorios deben comprender las diferencias entre los métodos de prueba disponibles. Los enfoques más utilizados incluyen inmunohistoquímica, PCR combinada con electroforesis capilar y secuenciación de próxima generación.

Cada método tiene sus propias ventajas, limitaciones y escenarios de aplicación ideales. Este artículo compara IHC, PCR-CE y NGS para la detección de MSI y explica por qué los estándares de referencia de MSI validados son esenciales para el desarrollo de ensayos y el control de calidad confiables.

Por qué son importantes las pruebas de MSI

MSI ocurre cuando secuencias cortas de ADN repetitivas, llamadas microsatélites, se vuelven inestables debido a errores de inserción o eliminación durante la replicación del ADN. En las células normales, estos errores se corrigen mediante el sistema de reparación de discrepancias. Cuando la función de reparación de desajustes es defectuosa, se pueden acumular errores, lo que provoca cambios en la longitud de los microsatélites.

Las pruebas de MSI son importantes porque el estado de MSI/dMMR puede proporcionar información valiosa para:

• Detección del síndrome de Lynch

• Caracterización de la biología tumoral.

• Evaluación de pronóstico de apoyo

• Guiar las decisiones relacionadas con el tratamiento

• Desarrollo y validación de ensayos de diagnóstico molecular.

• Apoyar la investigación oncológica y los estudios de biomarcadores.

Dado que el estado de MSI puede influir en la interpretación clínica y de investigación, el flujo de trabajo de las pruebas debe ser preciso, reproducible y estar bien validado.

Principales métodos de prueba de MSI

Los tres enfoques principales utilizados para la evaluación de MSI o dMMR son:

1. Inmunohistoquímica o IHC

2. Pruebas de MSI basadas en PCR, especialmente PCR-CE

3. Secuenciación de próxima generación o NGS

Aunque estos métodos están relacionados, no miden exactamente lo mismo. IHC evalúa la expresión de proteínas reparadoras de errores de coincidencia, mientras que PCR-CE y NGS evalúan directa o computacionalmente la inestabilidad de los microsatélites a nivel de secuencia de ADN.

IHC para la expresión de la proteína MMR

La inmunohistoquímica es uno de los métodos más utilizados para evaluar la deficiencia en la reparación de desajustes. En lugar de detectar directamente cambios en la longitud de los microsatélites, la IHC evalúa la expresión de proteínas clave MMR en el tejido tumoral.

Las proteínas comúnmente probadas incluyen:

• MLH1

• MSH2

• MSH6

• PMS2

Si una o más de estas proteínas están ausentes, se puede considerar que el tumor tiene una reparación deficiente. Debido a que la dMMR está fuertemente asociada con MSI-H, la IHC se utiliza a menudo como método de detección práctico.

Ventajas de la IHC

La IHC está ampliamente disponible en los laboratorios de patología y puede integrarse en flujos de trabajo de rutina basados ​​en tejidos. Proporciona información visual sobre la expresión de proteínas y puede ayudar a identificar qué proteína MMR se puede perder.

Por ejemplo, la pérdida de expresión de MLH1 y PMS2 puede sugerir un patrón biológico diferente al de la pérdida aislada de MSH6. Esto hace que la IHC sea útil no sólo para la detección sino también para guiar investigaciones futuras.

Limitaciones de la IHC

IHC no mide directamente la inestabilidad de los microsatélites. Sólo evalúa la expresión de proteínas. En algunos casos, la expresión de proteínas puede conservarse incluso cuando existen defectos funcionales. La interpretación también puede verse afectada por la calidad del tejido, las condiciones de tinción, la fijación, el rendimiento de los anticuerpos y la experiencia del patólogo.

Por lo tanto, la IHC es útil, pero en determinadas situaciones puede ser necesario respaldarla con pruebas moleculares.

PCR-CE para análisis de marcadores de microsatélites

PCR-CE es un método molecular que analiza directamente marcadores de microsatélites seleccionados. En este flujo de trabajo, regiones de microsatélites específicas se amplifican mediante PCR y luego se analizan mediante electroforesis capilar.

El propósito es detectar cambios en la longitud de los fragmentos. El ADN tumoral a menudo se compara con el ADN normal compatible para determinar si los marcadores microsatélite han cambiado de tamaño. Si varios marcadores muestran inestabilidad, la muestra puede clasificarse como MSI-H.

Los marcadores MSI comunes incluyen marcadores mononucleótidos como BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 y MONO-27. Algunos sistemas también pueden incluir marcadores adicionales como NR-27 o marcadores de pentanucleótidos para la identificación de muestras y el control de calidad.

Ventajas de la PCR-CE

PCR-CE es un método bien establecido para la detección de MSI. Proporciona información directa sobre el tamaño de los fragmentos para loci de microsatélites seleccionados y es adecuado para laboratorios que necesitan un flujo de trabajo de MSI específico y enfocado.

La PCR-CE puede resultar especialmente útil cuando los laboratorios desean un método de prueba de MSI dedicado en lugar de un enfoque amplio de perfiles genómicos.

Limitaciones de la PCR-CE

La PCR-CE suele analizar un número limitado de marcadores. Su rendimiento depende del panel de marcadores seleccionado, la calidad del ADN, el contenido del tumor y los criterios de interpretación.

Otra limitación es que la PCR-CE puede requerir ADN normal coincidente para una comparación más precisa, según el diseño del ensayo. Algunos flujos de trabajo pueden verse afectados por la calidad de la muestra o una fracción tumoral baja.

A pesar de estas limitaciones, la PCR-CE sigue siendo un método importante para las pruebas de MSI debido a su naturaleza específica y su claro resultado de análisis de fragmentos.

Detección de MSI basada en NGS

La secuenciación de próxima generación se ha convertido en un enfoque cada vez más importante para la detección de MSI. NGS puede evaluar muchas regiones genómicas simultáneamente y, a menudo, puede integrarse en flujos de trabajo de elaboración de perfiles tumorales más amplios.

El estado de MSI se puede inferir de:

• Paneles de genes dirigidos

• Secuenciación del exoma completo

• Secuenciación del genoma completo

• Otros conjuntos de datos de perfiles tumorales basados ​​en secuenciación

La detección de MSI basada en NGS generalmente se basa en algoritmos bioinformáticos que analizan regiones de microsatélites a través de datos de secuenciación. En lugar de examinar solo unos pocos marcadores, NGS puede evaluar una mayor cantidad de loci según el diseño del panel y el proceso analítico.

Ventajas de NGS

La mayor ventaja de NGS es su capacidad para combinar la detección de MSI con un perfil genómico más amplio. Un único flujo de trabajo de NGS puede proporcionar información sobre mutaciones, cambios en el número de copias, carga de mutaciones tumorales, fusiones de genes y estado de MSI, según el diseño del ensayo.

Esto hace que NGS sea atractivo para los laboratorios que ya realizan pruebas genómicas del cáncer integrales.

NGS también puede ofrecer análisis de alto rendimiento y puede reducir la necesidad de múltiples ensayos separados cuando ya existe un flujo de trabajo de secuenciación validado.

Limitaciones de NGS

La detección de MSI basada en NGS requiere una validación cuidadosa. El resultado depende no sólo del rendimiento del laboratorio húmedo sino también de la profundidad de la secuenciación, el diseño del panel, la cobertura de loci de microsatélites, la pureza del tumor, la calidad del ADN y los algoritmos bioinformáticos.

Es posible que diferentes paneles NGS no funcionen de la misma manera para la detección de MSI. Es posible que un panel diseñado principalmente para la detección de mutaciones no sea automáticamente óptimo para las llamadas MSI a menos que el rendimiento de MSI haya sido validado específicamente.

Por lo tanto, los estándares de referencia confiables son especialmente importantes para el desarrollo de ensayos MSI basados ​​en NGS y la verificación de tuberías.

IHC, PCR-CE y NGS: diferencias clave

Cómo elegir el método de prueba MSI adecuado

No existe un único método de prueba de MSI que sea ideal para cada laboratorio o cada aplicación. La mejor elección depende del propósito de la prueba, el tipo de muestra disponible, la infraestructura del laboratorio y los requisitos de validación.

Cuando se puede preferir la IHC

Se puede preferir la IHC cuando un laboratorio necesita un método de detección basado en tejidos para la expresión de proteínas reparadoras de errores de coincidencia. Se utiliza habitualmente en flujos de trabajo de patología y puede proporcionar información útil sobre qué proteínas MMR se pierden.

Cuándo se puede preferir la PCR-CE

Puede preferirse la PCR-CE cuando un laboratorio necesita un ensayo MSI molecular enfocado con análisis directo del tamaño de los fragmentos. Es útil para pruebas MSI dedicadas y para laboratorios que desean un flujo de trabajo específico basado en marcadores de microsatélites conocidos.

Cuando se puede preferir NGS

Puede preferirse la NGS cuando la detección de MSI es parte de un flujo de trabajo más amplio de elaboración de perfiles genómicos del cáncer. Es especialmente útil para laboratorios que ya utilizan paneles específicos o ensayos de secuenciación integrales.

Sin embargo, la detección de MSI basada en NGS debe validarse con materiales de referencia adecuados para garantizar que el ensayo y el proceso bioinformático puedan clasificar con precisión las muestras de MSI-H y MSS.

Por qué los estándares de referencia de MSI son importantes en todas las plataformas

Independientemente del método utilizado, las pruebas MSI requieren una validación y un control de calidad confiables. Los estándares de referencia ayudan a los laboratorios a confirmar que sus ensayos pueden detectar correctamente el estado conocido de MSI.

Los estándares de referencia de MSI pueden admitir:

• Desarrollo de ensayos

• Validación analítica

• Límite de evaluación de detección.

• Pruebas de control positivo y negativo.

• Estudios de reproducibilidad entre ejecuciones.

• Comparación de plataformas

• Formación de operadores

• Control de calidad de rutina

• Verificación del proceso bioinformático para NGS

Para PCR-CE, los estándares de referencia pueden ayudar a verificar la amplificación del marcador, el tamaño de los fragmentos y la clasificación de MSI.

Para NGS, los estándares de referencia pueden ayudar a evaluar el rendimiento de la secuenciación, la cobertura del panel, los algoritmos de llamada de MSI y la coherencia general del flujo de trabajo.

Para los desarrolladores de IVD, los estándares de referencia pueden respaldar el desarrollo de productos y la evaluación del rendimiento en diferentes diseños de ensayos.

Estándares de referencia CB-Gene MSI para flujos de trabajo PCR-CE y NGS

CB-Gene proporciona Estándares de referencia de MSI diseñados para respaldar la validación y el control de calidad de ensayos de diagnóstico molecular.

El producto CB-Gene MSI Reference Standard incluye muestras de ADN genómico emparejadas, incluido ADN derivado de tumores y ADN normal de referencia o emparejado. El conjunto de productos incluye muestras estables de microsatélites y muestras de MSI-H, lo que lo hace útil para evaluar si un ensayo puede distinguir correctamente MSS de MSI-H.

Según la información del producto CB-Gene, los estándares de referencia se confirman mediante el ensayo PCR-CE y el ensayo NGS. El sistema de análisis PCR-CE MSI incluye múltiples marcadores de nucleótidos como BAT-25, BAT-26, MONO-27, NR-21, NR-24 y NR-27 para tipificación de MSI.

Esto hace que los estándares sean adecuados para laboratorios que desarrollan, validan o monitorean flujos de trabajo de MSI basados ​​en plataformas PCR-CE o NGS.

Aplicaciones de los estándares de referencia de MSI

Los estándares de referencia CB-Gene MSI se pueden utilizar en varios escenarios técnicos y de desarrollo.

Validación del ensayo PCR-CE

Los laboratorios pueden utilizar los estándares MSI-H y MSS para verificar la amplificación por PCR, el rendimiento de la electroforesis capilar, la estabilidad de los marcadores y la precisión de la clasificación.

Validación del panel NGS

Los laboratorios de secuenciación pueden utilizar estándares de referencia para evaluar si su panel NGS y su línea de análisis pueden identificar correctamente el estado de MSI-H y MSS.

Verificación de canalización de bioinformática

Para la detección de MSI basada en NGS, el proceso computacional es una parte fundamental del flujo de trabajo de prueba. Los estándares de referencia con estado MSI confirmado pueden ayudar a verificar los algoritmos de llamada y los umbrales de clasificación de MSI.

Control de calidad

Se pueden incluir estándares de referencia en flujos de trabajo de control de calidad de rutina para monitorear la consistencia del ensayo a lo largo del tiempo.

Desarrollo de productos IVD

Los desarrolladores de ensayos de diagnóstico pueden utilizar materiales de referencia de MSI durante el desarrollo, la optimización y la evaluación del rendimiento del kit.

Conclusión

IHC, PCR-CE y NGS son métodos importantes para evaluar MSI o deficiencia de reparación de desajustes, pero difieren en lo que miden y cómo se utilizan.

IHC evalúa la expresión de la proteína MMR. PCR-CE analiza directamente los cambios de longitud de los marcadores de microsatélites seleccionados. NGS permite la detección de MSI dentro de flujos de trabajo más amplios de elaboración de perfiles genómicos del cáncer.

Dado que cada método tiene diferentes ventajas y limitaciones, los laboratorios deben elegir el flujo de trabajo adecuado en función de sus objetivos de prueba, la infraestructura disponible, el tipo de muestra y las necesidades de validación.

Los estándares de referencia MSI confiables son esenciales para generar confianza en el rendimiento del ensayo. Los estándares de referencia CB-Gene MSI proporcionan materiales de ADN genómico MSI-H y MSS confirmados para la validación de ensayos MSI basados ​​en PCR-CE y NGS, lo que ayuda a los laboratorios y desarrolladores de diagnósticos a mejorar la coherencia, la reproducibilidad y la confianza en las pruebas MSI.

Para obtener más información sobre los estándares de referencia CB-Gene MSI, comuníquese con CB-Gene para obtener detalles del producto, especificaciones técnicas y soporte de aplicaciones.