Estándares de referencia ATP7B para la validación del ensayo de la enfermedad de Wilson multiplataforma

Para los laboratorios que desarrollan y validan pruebas genéticas para la enfermedad de Wilson (EW), seleccionar los estándares de referencia ATP7B adecuados es una parte importante para establecer un ensayo controlado y reproducible. Las pruebas de la enfermedad de Wilson pueden utilizar secuenciación de Sanger, PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), PCR digital en gotas (ddPCR) o secuenciación dirigida de próxima generación (NGS). Cada flujo de trabajo requiere materiales de referencia de ADN genómico bien caracterizados para evaluar el rendimiento analítico, controlar la coherencia entre ensayos y respaldar la detección y el genotipado de variantes ATP7B confiables.

Los estándares de referencia ATP7B adecuados deben tener genotipos e identidades de variantes claramente definidos, una matriz de muestra relevante, compatibilidad con el método previsto y características alineadas con el plan de validación del laboratorio. Este artículo revisa las principales consideraciones al seleccionar los estándares de referencia ATP7B para la validación del ensayo de la enfermedad de Wilson multiplataforma.

I. El papel de los estándares de referencia ATP7B en la validación de ensayos

Un diseño de ensayo teórico por sí solo no es suficiente para validar una prueba ATP7B para la enfermedad de Wilson. Los laboratorios necesitan materiales de referencia bien caracterizados para desafiar el flujo de trabajo completo y evaluar la coherencia y precisión de las llamadas de genotipo. Los estándares de referencia ATP7B pueden ayudar a abordar preguntas prácticas durante el desarrollo de ensayos y las pruebas de rutina:

1. ¿Puede el ensayo distinguir los genotipos ATP7B de tipo salvaje, heterocigotos y homocigotos?

2. ¿Las mediciones de frecuencia de alelos variantes (VAF) son reproducibles en todas las series analíticas?

3. ¿El rendimiento del flujo de trabajo se mantiene constante cuando cambia el operador?

4. ¿Puede la plataforma de amplificación o secuenciación detectar consistentemente la variante ATP7B c.2333G>T (p.R778L) reportada en poblaciones de Asia Oriental?

5. ¿Puede el proceso bioinformático distinguir una variante que causa una verdadera enfermedad del ruido de fondo de la secuenciación?

6. ¿El flujo de trabajo, incluida la extracción de ácidos nucleicos, la preparación de bibliotecas y la amplificación, cuando corresponda, representa adecuadamente el flujo de trabajo de ADN genómico derivado de sangre periférica previsto?

Sin estándares de referencia ATP7B estandarizados, puede resultar difícil determinar si un resultado de genotipo inesperado surge del diseño de la muestra, del cebador o de la sonda, del rendimiento del instrumento, de la variación del lote de reactivos o del proceso de análisis de datos.

II. Criterios clave para seleccionar los estándares de referencia ATP7B

Al seleccionar materiales de referencia ATP7B para las pruebas de la enfermedad de Wilson, los laboratorios deben evaluar las siguientes características:

2.1 Se ha realizado una doble verificación del genotipo para abarcar las principales variaciones de los puntos críticos de la población de Asia oriental.

Un requisito principal es un genotipo claramente definido para una variante clínicamente relevante, caracterizada por métodos apropiados. Un conjunto de validación de ensayos de la enfermedad de Wilson debe incluir tres categorías principales de genotipos:

· Material de referencia ATP7B de tipo salvaje: un control negativo sin variante c.2333G>T

· Material de referencia de la variante heterocigótica ATP7B c.2333G>T: un control positivo que representa un genotipo portador heterocigótico

· Material de referencia de la variante homocigótica ATP7B c.2333G>T: un control positivo que representa un genotipo afectado homocigótico

La variante ATP7B c.2333G>T (p.Arg778Leu; p.R778L; rs28942074) se informa con frecuencia entre pacientes con enfermedad de Wilson en poblaciones de Asia oriental. Se puede utilizar un material de referencia de tipo salvaje para evaluar la especificidad analítica y las señales falsas positivas, mientras que se pueden utilizar materiales variantes heterocigotos y homocigotos para evaluar la detección y discriminación de genotipos. Los materiales con variantes positivas por sí solos no proporcionan un conjunto de validación completo; También se necesita un control de tipo salvaje para evaluar el comportamiento del ensayo en un entorno genómico negativo.

2.2 Matriz de ADN genómico humano relevante para pruebas clínicas

Las pruebas genéticas de la enfermedad de Wilson suelen utilizar ADN genómico extraído de sangre periférica. Un material de referencia ATP7B basado en ADN genómico humano proporciona un contexto de genoma completo y características de ADN que son más representativas de muestras de pruebas clínicas que los plásmidos o fragmentos sintéticos cortos. El grado en que representa efectos matriciales relacionados con la extracción depende del formato del material suministrado y su uso previsto.

· Ensayos basados ​​en PCR: el ADN genómico humano proporciona una base de genoma completo para evaluar la especificidad del cebador y el sesgo de amplificación específico del alelo en el locus ATP7B.

· Ensayos NGS: el ADN genómico se puede transportar mediante fragmentación, preparación de bibliotecas y pasos de enriquecimiento de objetivos para evaluar el rendimiento del flujo de trabajo. Su idoneidad para validar la extracción de ácidos nucleicos depende de si el material se suministra en una matriz que ingresa al flujo de trabajo antes de la extracción.

Para los estudios de validación destinados a reflejar las condiciones de las pruebas clínicas, los materiales de referencia de ADN genómico humano compatibles pueden proporcionar información más relevante que las plantillas sintéticas que contienen una sola variante.

2.3 Uso en flujos de trabajo de PCR y PCR digital

La secuenciación de Sanger, la qPCR y la PCR digital se utilizan habitualmente para detectar o cuantificar variantes de ATP7B mediante la amplificación dirigida de exones relevantes. Los estándares de referencia ATP7B diseñados para flujos de trabajo basados ​​en PCR y ddPCR pueden respaldar los siguientes estudios:

· Especificidad analítica de conjuntos de cebadores y sondas dirigidos a una variante de ATP7B

· Calibración o evaluación de la cuantificación absoluta del VAF mediante ddPCR

· Evaluación de señales de fondo de tipo salvaje y tasa de falsos positivos

· Evaluación de la reproducibilidad entre series de los resultados de amplificación

· Capacitación del operador y uso rutinario como controles de ensayo positivos y negativos.

2.4 Uso en la validación del panel NGS dirigido

Los paneles NGS dirigidos se utilizan para la detección de portadores de la enfermedad de Wilson y el análisis de la variante ATP7B, incluida la detección de la variante c.2333G>T y otras variantes patógenas o probablemente patógenas dentro de las regiones cubiertas por el panel. Las llamadas al genotipo ATP7B en un flujo de trabajo NGS pueden verse afectadas por el diseño del panel, la profundidad de la secuenciación, la uniformidad de la cobertura, la entrada de ADN, el sesgo de preparación de la biblioteca, los algoritmos de llamada de variantes y los umbrales de filtrado bioinformático. Los estándares de referencia ATP7B pueden respaldar la validación en todo el flujo de trabajo de NGS:

· Evaluación del rendimiento del enriquecimiento objetivo en los exones de ATP7B incluidos en el panel

· Evaluación de la profundidad de secuenciación y uniformidad de cobertura.

· Optimización de umbrales para llamadas de variantes heterocigotas

· Comparación multiplataforma de resultados basados ​​en PCR y NGS

· Monitoreo continuo del control de calidad del flujo de trabajo de secuenciación, cuando esté respaldado por la estabilidad del material y la documentación del uso previsto.

2.5 Un conjunto de genotipos múltiples para una validación más amplia

Un conjunto completo de estándares de referencia ATP7B no debe limitarse a una única muestra de tipo salvaje o variante positiva. Una combinación de materiales variantes de tipo salvaje, heterocigotos y homocigotos representa tres categorías de genotipo relevantes para individuos no afectados, portadores heterocigotos e individuos con un genotipo homocigoto. El conjunto se puede utilizar para evaluar el comportamiento del ensayo en diferentes orígenes genéticos y para construir un estudio de validación más completo.

III. Estándares de referencia CB-Gene ATP7B: un conjunto de ADN genómico multigenotipo para la validación del ensayo de la enfermedad de Wilson

CB-Gene ha desarrollado estándares de referencia de diagnóstico molecular ATP7B para el desarrollo y validación de ensayos multiplataforma de la enfermedad de Wilson. El conjunto de estándares de referencia CB-Gene ATP7B contiene tres materiales de ADN genómico humano que representan los genotipos principales de la variante ATP7B c.2333G>T (p.R778L):

 

Los genotipos del conjunto de estándares de referencia CB-Gene ATP7B se caracterizan mediante secuenciación Sanger, un método ortogonal ampliamente utilizado para la confirmación de variantes, y PCR digital. Los materiales están diseñados para su uso en flujos de trabajo de validación y desarrollo de ensayos de la enfermedad de Wilson basados ​​en PCR, ddPCR y NGS específicos.

IV. Cómo los estándares de referencia CB-Gene ATP7B respaldan la validación de PCR/ddPCR

Para flujos de trabajo basados ​​en amplificación, los estándares de referencia CB-Gene ATP7B se centran en la variante ATP7B c.2333G>T y se pueden utilizar en estudios de rendimiento de PCR/ddPCR que incluyen:

1. Evaluación de la amplificación específica en el exón objetivo ATP7B

2. Evaluación de la precisión de la ddPCR para la cuantificación absoluta de VAF

3. Discriminación de genotipos entre materiales de tipo salvaje, heterocigotos y homocigotos

4. Evaluación de la reproducibilidad entre ejecuciones y el rendimiento del instrumento.

5. Evaluación y minimización de señales variantes falsas positivas en un entorno genómico de tipo salvaje

Debido a que el conjunto incluye un material de tipo salvaje y dos materiales variantes positivas, puede proporcionar un conjunto de datos de validación más equilibrado que un único material de control.

V. Cómo los estándares de referencia CB-Gene ATP7B respaldan la validación del panel NGS dirigido

Para los flujos de trabajo de secuenciación, los estándares de referencia ATP7B de CB-Gene pueden respaldar la evaluación tanto de procesos de laboratorio húmedo como de análisis bioinformáticos:

Evaluación de laboratorio húmedo

Los materiales de ADN genómico se pueden introducir en la etapa adecuada del flujo de trabajo para evaluar la tolerancia a la entrada de ADN, la eficiencia de la preparación de la biblioteca y la uniformidad de cobertura en toda la región ATP7B objetivo. La validación del paso de extracción requiere un material suministrado en una matriz de preextracción adecuada.

Evaluación Bioinformática

Los materiales se pueden utilizar para evaluar si los algoritmos de llamada de variantes y los umbrales de filtrado identifican correctamente los genotipos c.2333G>T heterocigotos y homocigotos y para evaluar resultados falsos negativos y falsos positivos.

Los estándares de referencia pueden soportar los siguientes escenarios de validación NGS:

1. Evaluación del rendimiento del enriquecimiento objetivo para un panel de genes dirigidos a ATP7B

2. Optimización de umbrales de llamada de variantes heterocigotas

3. Evaluación de la concordancia multiplataforma entre los resultados de secuenciación de Sanger, ddPCR y NGS

4. Monitoreo continuo del control de calidad del flujo de trabajo de secuenciación, cuando esté respaldado por los datos de estabilidad del material y el uso previsto.

Para los laboratorios que desarrollan paneles de enfermedades hereditarias multigénicas que incluyen ATP7B, los materiales de referencia caracterizados por la secuenciación de Sanger y la ddPCR pueden proporcionar evidencia ortogonal para evaluar las llamadas de genotipo.

VI. Un plan de validación estructurado utilizando los estándares de referencia ATP7B

Un estudio de validación del ensayo ATP7B de la enfermedad de Wilson puede utilizar el siguiente diseño gradual:

Paso 1: Pruebe el material de referencia de tipo salvaje

Pruebe WT-W1 primero para evaluar llamadas de variantes falsas positivas en un fondo genómico normal, evaluar la especificidad analítica y establecer umbrales de ruido de fondo para amplificación o secuenciación.

Paso 2: Probar los materiales variantes heterocigotos y homocigotos

Pruebe HET-W2 y HOM-W3 para evaluar la detección y discriminación de genotipos heterocigotos y homocigotos c.2333G>T y para evaluar la sensibilidad analítica y la precisión de las llamadas de genotipo previstas.

Paso 3: realizar pruebas repetidas en todas las condiciones

Pruebe los tres materiales de referencia en diferentes fechas, con diferentes operadores y en lotes de reactivos relevantes para evaluar la reproducibilidad y la variabilidad entre lotes del flujo de trabajo completo.

Paso 4: comparar resultados entre plataformas

Los laboratorios que utilizan PCR/ddPCR y NGS pueden probar el mismo conjunto de estándares de referencia ATP7B para evaluar la concordancia de genotipos entre plataformas. Los datos resultantes de comparación y correlación de métodos pueden respaldar la documentación preparada para el registro de ensayos o la acreditación de laboratorio, sujeto a los requisitos reglamentarios y de acreditación aplicables.

Paso 5: incorporar los materiales al control de calidad de rutina

Después de la validación del ensayo, el conjunto de estándares de referencia ATP7B se puede incorporar al control de calidad de rutina como controles positivos y negativos para monitorear el rendimiento del flujo de trabajo a lo largo del tiempo, siempre que el uso previsto y los datos de estabilidad disponibles respalden esta aplicación.

VII. Resumen

Los estándares de referencia ATP7B bien caracterizados que representan genotipos relevantes proporcionan una base para evaluar un flujo de trabajo de pruebas de enfermedad de Wilson multiplataforma reproducible. Se puede utilizar un conjunto que contiene materiales de ADN genómico humano de tipo salvaje, heterocigotos y homocigotos para evaluar la precisión del genotipo, el rendimiento cuantitativo, la reproducibilidad y la solidez general del ensayo.

Los estándares de referencia CB-Gene ATP7B incluyen materiales de ADN genómico humano de tipo salvaje, heterocigoto y homocigoto para la variante c.2333G>T. Los genotipos se caracterizan mediante secuenciación Sanger y PCR digital. Los materiales están destinados a respaldar el desarrollo de ensayos de la enfermedad de Wilson, la validación analítica, la comparación entre plataformas, la evaluación de la línea bioinformática y el control de calidad de laboratorio de rutina, según corresponda al uso previsto documentado del producto.

Para los laboratorios de diagnóstico molecular clínico, los equipos de investigación de enfermedades genéticas y los desarrolladores de diagnósticos in vitro, los estándares de referencia CB-Gene ATP7B proporcionan materiales de control de calidad estandarizados en un contexto de ADN genómico humano para los flujos de trabajo de detección de la enfermedad de Wilson y pruebas moleculares.

Comuníquese con CB-Gene para obtener información detallada sobre el producto, instrucciones de uso y soporte técnico para los estándares de referencia ATP7B utilizados en la validación de pruebas genéticas multiplataforma.