Étalons de référence ATP7B pour la validation du test multiplateforme de la maladie de Wilson

Pour les laboratoires développant et validant des tests génétiques pour la maladie de Wilson (WD), la sélection des étalons de référence ATP7B appropriés est un élément important de l’établissement d’un test contrôlé et reproductible. Les tests de la maladie de Wilson peuvent utiliser le séquençage de Sanger, la PCR quantitative en temps réel (qPCR), la PCR numérique en gouttelettes (ddPCR) ou le séquençage ciblé de nouvelle génération (NGS). Chaque flux de travail nécessite des matériaux de référence d'ADN génomique bien caractérisés pour évaluer les performances analytiques, surveiller la cohérence d'une analyse à l'autre et prendre en charge une détection et un génotypage fiables des variantes ATP7B.

Les étalons de référence ATP7B appropriés doivent avoir des génotypes et des identités de variantes clairement définis, une matrice d'échantillons pertinente, une compatibilité avec la méthode prévue et des caractéristiques alignées sur le plan de validation du laboratoire. Cet article passe en revue les principales considérations lors de la sélection des étalons de référence ATP7B pour la validation multiplateforme du test de la maladie de Wilson.

I. Le rôle des étalons de référence ATP7B dans la validation des tests

Un modèle de test théorique ne suffit pas à lui seul pour valider un test ATP7B pour la maladie de Wilson. Les laboratoires ont besoin de matériaux de référence bien caractérisés pour tester l'ensemble du flux de travail et évaluer la cohérence et l'exactitude des appels de génotype. Les étalons de référence ATP7B peuvent aider à répondre à des questions pratiques lors du développement de tests et des tests de routine :

1. Le test peut-il distinguer les génotypes ATP7B de type sauvage, hétérozygote et homozygote ?

2. Les mesures de fréquence allélique variable (VAF) sont-elles reproductibles d’une série d’analyses à l’autre ?

3. Les performances du flux de travail restent-elles cohérentes lorsque l'opérateur change ?

4. La plateforme d'amplification ou de séquençage peut-elle détecter systématiquement le variant ATP7B c.2333G>T (p.R778L) signalé dans les populations d'Asie de l'Est ?

5. Le pipeline bioinformatique peut-il distinguer une véritable variante pathogène du bruit de fond du séquençage ?

6. Le flux de travail, y compris l'extraction d'acide nucléique, la préparation de la bibliothèque et l'amplification, le cas échéant, représente-t-il de manière adéquate le flux de travail prévu pour l'ADN génomique dérivé du sang périphérique ?

Sans étalons de référence ATP7B standardisés, il peut être difficile de déterminer si un résultat inattendu du génotype résulte de la conception de l'échantillon, de l'amorce ou de la sonde, des performances de l'instrument, de la variation du lot de réactifs ou du pipeline d'analyse des données.

II. Critères clés de sélection des étalons de référence ATP7B

Lors de la sélection des matériaux de référence ATP7B pour les tests de la maladie de Wilson, les laboratoires doivent évaluer les caractéristiques suivantes :

2.1 Le génotype a été doublement vérifié pour couvrir les principales variations des points chauds de la population d'Asie de l'Est.

Une exigence principale est un génotype clairement défini pour une variante cliniquement pertinente, caractérisée par des méthodes appropriées. Un ensemble de validation du test de la maladie de Wilson doit inclure trois catégories de génotypes principales :

· Matériel de référence de type sauvage ATP7B : un contrôle négatif sans variante c.2333G>T

· Matériel de référence variant hétérozygote ATP7B c.2333G>T : un contrôle positif représentant un génotype porteur hétérozygote

· Matériel de référence de variant homozygote ATP7B c.2333G>T : un contrôle positif représentant un génotype homozygote affecté

La variante ATP7B c.2333G>T (p.Arg778Leu; p.R778L; rs28942074) est fréquemment rapportée chez les patients atteints de la maladie de Wilson dans les populations d'Asie de l'Est. Un matériel de référence de type sauvage peut être utilisé pour évaluer la spécificité analytique et les signaux faussement positifs, tandis que des matériaux variants hétérozygotes et homozygotes peuvent être utilisés pour évaluer la détection et la discrimination du génotype. Les matériaux positifs pour les variantes ne fournissent pas à eux seuls un ensemble de validation complet ; un contrôle de type sauvage est également nécessaire pour évaluer le comportement du test dans un contexte génomique négatif.

2.2 Matrice d’ADN génomique humain pertinente pour les tests cliniques

Les tests génétiques de la maladie de Wilson utilisent généralement l’ADN génomique extrait du sang périphérique. Un matériau de référence ATP7B basé sur l’ADN génomique humain fournit un contexte génomique entier et des caractéristiques d’ADN plus représentatives des échantillons de tests cliniques que les plasmides ou les courts fragments synthétiques. La mesure dans laquelle il représente les effets de matrice liés à l'extraction dépend du format de matériau fourni et de son utilisation prévue.

· Tests basés sur la PCR : l'ADN génomique humain fournit un contexte génomique entier pour évaluer la spécificité des amorces et le biais d'amplification spécifique à l'allèle au locus ATP7B.

· Tests NGS : l'ADN génomique peut être transporté via des étapes de fragmentation, de préparation de bibliothèques et d'enrichissement de cibles pour évaluer les performances du flux de travail. Son adéquation à la validation de l’extraction d’acide nucléique dépend du fait que le matériel soit fourni dans une matrice qui entre dans le flux de travail avant l’extraction.

Pour les études de validation destinées à refléter les conditions des tests cliniques, les matériaux de référence d’ADN génomique humain appariés peuvent fournir des informations plus pertinentes que les modèles synthétiques ne contenant qu’un seul variant.

2.3 Utilisation dans les flux de travail PCR et PCR numérique

Le séquençage Sanger, la qPCR et la PCR numérique sont couramment utilisés pour détecter ou quantifier les variantes d'ATP7B grâce à une amplification ciblée des exons pertinents. Les normes de référence ATP7B conçues pour les flux de travail basés sur la PCR et la ddPCR peuvent prendre en charge les études suivantes :

· Spécificité analytique des ensembles d'amorces et de sondes ciblant un variant d'ATP7B

· Calibrage ou évaluation de la quantification absolue du VAF par ddPCR

· Évaluation des signaux de fond de type sauvage et du taux de faux positifs

· Évaluation de la reproductibilité inter-analyses des résultats d'amplification

· Formation des opérateurs et utilisation de routine comme contrôles d'analyse positifs et négatifs

2.4 Utilisation dans la validation ciblée du panel NGS

Les panels NGS ciblés sont utilisés pour le dépistage des porteurs de la maladie de Wilson et l'analyse des variantes ATP7B, y compris la détection du variant c.2333G>T et d'autres variants pathogènes ou probablement pathogènes dans les régions couvertes par le panel. Les appels de génotype ATP7B dans un flux de travail NGS peuvent être affectés par la conception du panel, la profondeur de séquençage, l'uniformité de la couverture, l'entrée d'ADN, le biais de préparation de bibliothèque, les algorithmes d'appel de variantes et les seuils de filtrage bioinformatique. Les normes de référence ATP7B peuvent prendre en charge la validation tout au long du flux de travail NGS :

· Évaluation des performances d'enrichissement de la cible sur les exons ATP7B inclus dans le panel

· Évaluation de la profondeur de séquençage et de l'uniformité de la couverture

· Optimisation des seuils pour les appels de variantes hétérozygotes

· Comparaison multiplateforme des résultats basés sur PCR et NGS

· Surveillance continue du contrôle de qualité du flux de travail de séquençage, lorsque soutenu par la stabilité du matériau et la documentation sur l'utilisation prévue

2.5 Un ensemble multigénotype pour une validation plus large

Un ensemble complet d’étalons de référence ATP7B ne doit pas être limité à un seul échantillon de type sauvage ou positif à un variant. Une combinaison de matériels variants de type sauvage, hétérozygotes et homozygotes représente trois catégories de génotypes pertinentes pour les individus non affectés, les porteurs hétérozygotes et les individus ayant un génotype homozygote. L’ensemble peut être utilisé pour évaluer le comportement des tests sur différents fonds génétiques et pour construire une étude de validation plus complète.

III. Étalons de référence CB-Gene ATP7B : un ensemble d'ADN génomique multigénotype pour la validation du test de la maladie de Wilson

CB-Gene a développé des normes de référence de diagnostic moléculaire ATP7B pour le développement et la validation de tests multiplateformes sur la maladie de Wilson. L'ensemble d'étalons de référence CB-Gene ATP7B contient trois matériaux d'ADN génomique humain représentant les principaux génotypes de la variante ATP7B c.2333G>T (p.R778L) :

 

Les génotypes de l’ensemble d’étalons de référence CB-Gene ATP7B sont caractérisés à l’aide du séquençage Sanger, une méthode orthogonale largement utilisée pour la confirmation des variantes, et de la PCR numérique. Les matériaux sont conçus pour être utilisés dans certains flux de travail de développement et de validation de tests de maladie de Wilson basés sur la PCR, la ddPCR et le NGS ciblé.

IV. Comment les standards de référence CB-Gene ATP7B prennent en charge la validation PCR/ddPCR

Pour les flux de travail basés sur l'amplification, les standards de référence CB-Gene ATP7B se concentrent sur la variante ATP7B c.2333G>T et peuvent être utilisés dans les études de performances PCR/ddPCR qui incluent :

1. Évaluation de l’amplification spécifique à l’exon cible ATP7B

2. Évaluation de l’exactitude du ddPCR pour la quantification absolue du VAF

3. Discrimination génotypique parmi les matériels de type sauvage, hétérozygotes et homozygotes

4. Évaluation de la reproductibilité inter-séries et des performances des instruments

5. Évaluation et minimisation des signaux de variantes faussement positifs dans un contexte génomique de type sauvage

Étant donné que l’ensemble comprend un matériel de type sauvage et deux matériaux à variantes positives, il peut fournir un ensemble de données de validation plus équilibré qu’un seul matériel de contrôle.

V. Comment les standards de référence CB-Gene ATP7B prennent en charge la validation ciblée du panel NGS

Pour les flux de travail de séquençage, les normes de référence ATP7B de CB-Gene peuvent prendre en charge l'évaluation des processus de laboratoire humide et l'analyse bioinformatique :

Évaluation en laboratoire humide

Les matériaux d'ADN génomique peuvent être introduits à l'étape appropriée du flux de travail pour évaluer la tolérance à l'entrée d'ADN, l'efficacité de préparation de bibliothèque et l'uniformité de la couverture dans la région ATP7B ciblée. La validation de l’étape d’extraction nécessite un matériau fourni dans une matrice de pré-extraction adaptée.

Évaluation bioinformatique

Les matériaux peuvent être utilisés pour évaluer si les algorithmes d'appel de variantes et les seuils de filtrage identifient correctement les génotypes hétérozygotes et homozygotes c.2333G>T et pour évaluer les résultats faussement négatifs et faussement positifs.

Les normes de référence peuvent prendre en charge les scénarios de validation NGS suivants :

1. Évaluation des performances d’enrichissement de cibles pour un panel de gènes ciblés ATP7B

2. Optimisation des seuils d’appel de variantes hétérozygotes

3. Évaluation de la concordance multiplateforme entre les résultats du séquençage Sanger, du ddPCR et du NGS

4. Surveillance continue du contrôle de qualité du flux de travail de séquençage, lorsque cela est soutenu par les données de stabilité du matériau et l'utilisation prévue

Pour les laboratoires développant des panels de maladies héréditaires multigéniques comprenant ATP7B, les matériaux de référence caractérisés par le séquençage de Sanger et la ddPCR peuvent fournir des preuves orthogonales pour évaluer les appels de génotype.

VI. Un plan de validation structuré utilisant les normes de référence ATP7B

Une étude de validation du test ATP7B sur la maladie de Wilson peut utiliser la conception par étapes suivante :

Étape 1 : tester le matériel de référence de type sauvage

Testez d’abord WT-W1 pour évaluer les appels de variants faussement positifs dans un contexte génomique normal, évaluez la spécificité analytique et établissez des seuils de bruit de fond pour l’amplification ou le séquençage.

Étape 2 : tester les matériaux variantes hétérozygotes et homozygotes

Testez HET-W2 et HOM-W3 pour évaluer la détection et la discrimination des génotypes hétérozygotes et homozygotes c.2333G>T et pour évaluer la sensibilité et l’exactitude analytiques des appels de génotype prévus.

Étape 3 : Effectuer des tests répétés dans toutes les conditions

Testez les trois matériaux de référence à différentes dates, avec différents opérateurs et sur les lots de réactifs pertinents pour évaluer la reproductibilité et la variabilité inter-lots du flux de travail complet.

Étape 4 : Comparez les résultats sur toutes les plates-formes

Les laboratoires utilisant à la fois la PCR/ddPCR et le NGS peuvent tester le même ensemble d’étalons de référence ATP7B pour évaluer la concordance des génotypes multiplateformes. Les données de comparaison et de corrélation des méthodes qui en résultent peuvent étayer la documentation préparée pour l'enregistrement des tests ou l'accréditation du laboratoire, sous réserve des exigences réglementaires et d'accréditation applicables.

Étape 5 : Incorporer les matériaux dans le contrôle qualité de routine

Après validation du test, l'ensemble d'étalons de référence ATP7B peut être incorporé au contrôle qualité de routine en tant que contrôles positifs et négatifs pour surveiller les performances du flux de travail au fil du temps, à condition que l'utilisation prévue et les données de stabilité disponibles soutiennent cette application.

VII. Résumé

Les étalons de référence ATP7B bien caractérisés représentant les génotypes pertinents fournissent une base pour évaluer un flux de travail de test de la maladie de Wilson multiplateforme reproductible. Un ensemble contenant des matériaux d’ADN génomique humain de type sauvage, hétérozygote et homozygote peut être utilisé pour évaluer l’exactitude du génotype, les performances quantitatives, la reproductibilité et la robustesse globale du test.

Les normes de référence CB-Gene ATP7B incluent du matériel d’ADN génomique humain de type sauvage, hétérozygote et homozygote pour la variante c.2333G>T. Les génotypes sont caractérisés par séquençage Sanger et PCR numérique. Les matériaux sont destinés à soutenir le développement du test de la maladie de Wilson, la validation analytique, la comparaison multiplateforme, l'évaluation du pipeline bioinformatique et le contrôle qualité de routine en laboratoire, selon l'utilisation prévue documentée du produit.

Pour les laboratoires de diagnostic moléculaire clinique, les équipes de recherche sur les maladies génétiques et les développeurs de diagnostics in vitro, les étalons de référence CB-Gene ATP7B fournissent des matériaux de contrôle qualité standardisés dans un contexte d'ADN génomique humain pour les flux de travail de dépistage de la maladie de Wilson et de tests moléculaires.

Contactez CB-Gene pour obtenir des informations détaillées sur le produit, des instructions d'utilisation et une assistance technique pour les normes de référence ATP7B utilisées dans la validation des tests génétiques multiplateformes.