Comment choisir les étalons de référence MSI pour la validation des tests PCR-CE et NGS

Pour les laboratoires développant ou validant des tests d’instabilité des microsatellites, choisir le bon étalon de référence MSI est une étape cruciale. Les tests MSI ne consistent pas seulement à détecter l’instabilité. Il s’agit également de prouver que le test peut distinguer de manière cohérente les échantillons MSI-H des échantillons MSS dans des conditions de test réelles.

Ceci est particulièrement important pour les laboratoires utilisant des flux de travail basés sur PCR-CE ou NGS. Les deux méthodes nécessitent des matériaux de contrôle fiables pour évaluer les performances du test, surveiller la cohérence du flux de travail et garantir la confiance dans la classification MSI.

Un étalon de référence MSI approprié ne doit pas seulement avoir un statut MSI connu. Il doit également correspondre à l'application prévue, au type d'échantillon, à la plate-forme analytique et à l'objectif de validation.

Cet article explique ce que les laboratoires doivent prendre en compte lors de la sélection des étalons de référence MSI pour la validation des tests PCR-CE et NGS.

Pourquoi les normes de référence MSI sont importantes dans la validation des tests

La validation du test MSI nécessite plus qu’un protocole de test théorique. Les laboratoires ont besoin de matériaux caractérisés capables de tester le test et de confirmer si le flux de travail fonctionne comme prévu.

UN L’étalon de référence MSI de haute qualité permet de répondre à plusieurs questions pratiques :

• Le test peut-il identifier correctement les échantillons MSI-H ?

• Le test peut-il identifier correctement les échantillons MSS ?

• Les résultats sont-ils reproductibles sur différentes analyses ?

• Le flux de travail fonctionne-t-il de manière cohérente entre les différents opérateurs ?

• La plateforme peut-elle détecter l’état MSI à l’aide du panneau de marqueurs sélectionné ou de la conception de séquençage ?

• Le pipeline bioinformatique classe-t-il correctement les échantillons MSI-H et MSS connus ?

Sans étalons de référence appropriés, il est difficile d'évaluer si des résultats inattendus sont provoqués par l'échantillon, la conception du test, l'instrument, le lot de réactifs ou le processus d'analyse des données.

Principales fonctionnalités à rechercher dans une norme de référence MSI

Lors de la sélection des matériaux de référence MSI, les laboratoires doivent évaluer plusieurs caractéristiques importantes.

1. Statut MSI clairement confirmé

La première exigence est un statut MSI clairement défini.

Pour la validation des tests MSI, les laboratoires ont généralement besoin de matériaux de référence positifs et négatifs :

• Étalons de référence MSI-H comme contrôles positifs

• Étalons de référence MSS comme contrôles négatifs ou stables

Les matériaux MSI-H aident à confirmer que le test peut détecter l’instabilité des microsatellites. Les matériaux MSS permettent de vérifier que le test ne classe pas incorrectement les échantillons stables comme instables.

Pour un flux de validation complet, utiliser uniquement des matériaux MSI-H ne suffit pas. Les laboratoires ont également besoin de matériaux MSS pour évaluer la spécificité et l'exactitude de la classification.

2. Disponibilité de tumeurs appariées et d’ADNg normal

L’ADN génomique apparié tumeur-normal est très utile pour les tests MSI, car de nombreux flux de travail MSI comparent l’ADN tumoral à l’ADN normal.

Dans les flux de travail PCR-CE, l’ADN normal apparié peut fournir une base de référence pour la comparaison de la taille des fragments. Cela aide les laboratoires à identifier les changements spécifiques à la tumeur dans les marqueurs microsatellites.

Dans les flux de travail NGS, des matériaux appariés à des tumeurs normales peuvent prendre en charge le développement de flux de travail, des stratégies de comparaison de tumeurs normales et la vérification du pipeline.

Pour les laboratoires qui souhaitent un modèle de validation plus réaliste, une tumeur appariée et un ADNg normal sont plus informatifs que des matériaux de contrôle uniques non appariés.

3. Compatibilité avec les flux de travail PCR-CE

La PCR-CE reste une méthode largement utilisée pour la détection des MSI. Il repose sur l’amplification PCR de marqueurs microsatellites sélectionnés, suivie d’une analyse de fragments basée sur l’électrophorèse capillaire.

Lors du choix des étalons de référence MSI pour PCR-CE, les laboratoires doivent déterminer si le matériel prend en charge les marqueurs utilisés dans leur test.

Les marqueurs MSI courants comprennent :

• BAT-25

• BAT-26

• MONO-27

• NR-21

• NR-24

• NR-27

Les étalons de référence dont les performances sont connues sur ces marqueurs peuvent aider les laboratoires à vérifier l’amplification, la taille des fragments, l’instabilité des marqueurs et la classification MSI.

Pour les flux de travail PCR-CE, des étalons de référence appropriés peuvent être utilisés pour prendre en charge :

• Vérification du panneau de balisage

• Cohérence de l'analyse des fragments

• Classement MSI-H et MSS

• Reproductibilité inter-analyses

• Formation des opérateurs

• Tests de contrôle positifs et négatifs de routine

4. Compatibilité avec la détection MSI basée sur NGS

Les tests MSI basés sur NGS deviennent de plus en plus courants car les laboratoires peuvent intégrer la détection des MSI dans des flux de travail plus larges de profilage génomique du cancer.

Cependant, la détection MSI basée sur NGS dépend de plusieurs facteurs techniques, notamment :

• Conception des panneaux

• Profondeur de séquençage

• Couverture des locus microsatellites

• Qualité de l'ADN

• Fraction tumorale

• Préparation de la bibliothèque

• Algorithme d'appel MSI

• Paramètres de seuil bioinformatique

En raison de cette complexité, les flux de travail NGS nécessitent des matériaux de référence soigneusement sélectionnés.

Les normes de référence MSI peuvent aider les laboratoires à évaluer si le flux de travail complet du NGS, de l'entrée ADN à l'appel MSI final, peut classer correctement les échantillons MSI-H et MSS connus.

Pour la validation des tests NGS, les normes de référence peuvent prendre en charge :

• Validation de panel ciblée

• Vérification du flux de travail de séquençage

• Évaluation de l'algorithme MSI

• Tests de pipeline bioinformatique

• Comparaison multiplateforme

• Surveillance de la qualité à long terme

5. Plusieurs types d'échantillons pour une couverture de validation plus large

Un ensemble d’étalons de référence MSI solides doit fournir plus d’un échantillon positif et un échantillon négatif. Plusieurs échantillons permettent aux laboratoires d’évaluer les performances des tests sur différents fonds génétiques et sources de tumeurs.

Ceci est utile car la détection des MSI peut être affectée par les caractéristiques de l’échantillon, l’origine de la tumeur, la qualité de l’ADN et le comportement des marqueurs.

Un ensemble d’étalons de référence comprenant plusieurs échantillons MSI-H et MSS permet aux laboratoires de concevoir une étude de validation plus complète et de mieux évaluer la robustesse du flux de travail.

Étalons de référence CB-Gene MSI : 12 échantillons appariés pour la validation MSI

CB-Gene fournit des étalons de référence MSI conçus pour la validation des tests MSI basés sur PCR-CE et NGS.

L’ensemble d’étalons de référence CB-Gene MSI comprend 12 paires de matériaux de référence d’ADN génomique. Chaque paire contient un échantillon d’ADNg dérivé d’une tumeur et un échantillon d’ADNg normal ou de référence correspondant.

L'ensemble de produits comprend :

Cette conception à 12 paires offre aux laboratoires des matériaux MSI-H et MSS pour la validation des tests, la comparaison des méthodes et le contrôle qualité.

Le statut MSI de ces étalons de référence est confirmé par les tests PCR-CE et NGS, ce qui les rend adaptés aux laboratoires travaillant soit avec l'analyse de fragments, soit avec la détection de MSI basée sur le séquençage.

Comment les normes de référence CB-Gene MSI prennent en charge la validation PCR-CE

Pour les flux de travail PCR-CE, les étalons de référence CB-Gene MSI peuvent être utilisés pour évaluer si le test peut détecter les changements attendus des marqueurs microsatellites.

Les standards conviennent à l'analyse PCR-CE MSI impliquant des marqueurs tels que BAT-25, BAT-26, MONO-27, NR-21, NR-24 et NR-27.

Les laboratoires peuvent utiliser ces matériaux pour vérifier :

• Performances d'amplification PCR

• Dimensionnement des fragments d'électrophorèse capillaire

• Comparaison tumeur-normale

• Modèles d'instabilité des marqueurs

• Classement MSI-H

• Classement MSS

• Cohérence d'une exécution à l'autre

Étant donné que l'ensemble comprend à la fois des échantillons MSI-H et MSS, il peut prendre en charge une conception de validation plus équilibrée que l'utilisation d'un seul matériau de contrôle.

Comment les normes de référence CB-Gene MSI prennent en charge la validation NGS

Pour les flux de travail NGS, les normes de référence CB-Gene MSI peuvent être utilisées pour évaluer les performances en laboratoire humide et en laboratoire sec.

Dans le processus de laboratoire humide, les matériaux peuvent aider à évaluer l’apport d’ADN, la préparation de la bibliothèque, la qualité du séquençage et les performances des panels.

Dans le processus de laboratoire sec, les mêmes matériaux peuvent aider à évaluer si l'algorithme d'appel MSI classe correctement les échantillons MSI-H et MSS connus.

Ces normes peuvent prendre en charge les activités de validation NGS telles que :

• Validation d'un panel de gènes ciblés

• Vérification de l'algorithme d'appel MSI

• Optimisation du pipeline bioinformatique

• Études de reproductibilité inter-séries

• Comparaison multiplateforme entre PCR-CE et NGS

• Contrôle qualité de routine pour la détection des MSI basée sur le séquençage

Pour les laboratoires développant une détection MSI basée sur NGS, l’utilisation d’étalons de référence confirmés à la fois par PCR-CE et NGS offre un niveau de confiance supplémentaire.

Conception de validation suggérée à l'aide des normes de référence MSI

Un flux de travail pratique de validation MSI peut inclure les étapes suivantes.

Étape 1 : tester les normes de référence MSS

Commencez par tester les matériaux MSS pour confirmer que le test ne génère pas de faux appels MSI-H.

Cette étape permet d’évaluer la spécificité du test et la stabilité de base.

Étape 2 : tester les normes de référence MSI-H

Ensuite, testez les matériaux MSI-H pour confirmer que le test peut détecter l’instabilité des microsatellites.

Cette étape permet d’évaluer la sensibilité du test et les performances de classification positive.

Étape 3 : Répéter sur plusieurs exécutions

Tester les mêmes étalons de référence sur plusieurs analyses permet d’évaluer la reproductibilité.

Ceci est utile pour surveiller les variations causées par différents jours, opérateurs, lots de réactifs ou instruments.

Étape 4 : Comparez les résultats PCR-CE et NGS

Pour les laboratoires utilisant les deux méthodes, les mêmes matériaux de référence peuvent être utilisés pour comparer les classifications PCR-CE et NGS.

Cela peut aider à prendre en charge les études de corrélation de méthodes et de transition de plate-forme.

Étape 5 : Utiliser des étalons de référence pour le CQ de routine

Après validation, les étalons de référence MSI peuvent continuer à être utilisés comme contrôles positifs et négatifs dans les programmes de contrôle qualité de routine.

Conclusion

La sélection du bon étalon de référence MSI est essentielle pour une validation fiable des tests PCR-CE et NGS. Les laboratoires ont besoin de matériaux MSI-H et MSS bien caractérisés pour évaluer la précision, la reproductibilité, les performances de classification et la stabilité du flux de travail.

Les étalons de référence CB-Gene MSI fournissent 12 matériaux de référence d'ADN génomique appariés, dont MSS-P1 à MSS-P4 et MSI-H-U1 à MSI-H-U8. Les normes sont confirmées par les tests PCR-CE et NGS et sont conçues pour prendre en charge la validation des tests MSI, le contrôle qualité, la comparaison des plateformes et la vérification du pipeline bioinformatique.

Pour les laboratoires et les développeurs de diagnostics travaillant sur les tests MSI, les normes de référence CB-Gene MSI offrent du matériel de contrôle pratique pour créer des flux de travail de détection MSI fiables et reproductibles.

Contactez CB-Gene pour en savoir plus sur les normes de référence MSI pour la validation des tests PCR-CE et NGS.