Cómo elegir los estándares de referencia de MSI para la validación de ensayos PCR-CE y NGS

Para los laboratorios que desarrollan o validan pruebas de inestabilidad de microsatélites, elegir el estándar de referencia MSI adecuado es un paso fundamental. Las pruebas MSI no consisten sólo en detectar inestabilidad. También se trata de demostrar que el ensayo puede distinguir consistentemente muestras de MSI-H de muestras de MSS en condiciones de prueba reales.

Esto es especialmente importante para los laboratorios que utilizan flujos de trabajo basados ​​en PCR-CE o NGS. Ambos métodos requieren materiales de control confiables para evaluar el rendimiento del ensayo, monitorear la coherencia del flujo de trabajo y respaldar la confianza en la clasificación MSI.

Un estándar de referencia MSI adecuado no sólo debe tener un estado MSI conocido. También debe coincidir con la aplicación prevista, el tipo de muestra, la plataforma analítica y el propósito de validación.

Este artículo explica qué deben considerar los laboratorios al seleccionar los estándares de referencia MSI para la validación de ensayos PCR-CE y NGS.

Por qué los estándares de referencia de MSI son importantes en la validación de ensayos

La validación del ensayo MSI requiere más que un protocolo de prueba teórico. Los laboratorios necesitan materiales caracterizados que puedan desafiar el ensayo y confirmar si el flujo de trabajo funciona como se esperaba.

A El estándar de referencia MSI de alta calidad ayuda a responder varias preguntas prácticas:

• ¿Puede el ensayo identificar correctamente las muestras de MSI-H?

• ¿Puede el ensayo identificar correctamente muestras de MSS?

• ¿Los resultados son reproducibles en diferentes ejecuciones?

• ¿El flujo de trabajo funciona de manera consistente entre diferentes operadores?

• ¿Puede la plataforma detectar el estado de MSI utilizando el panel de marcadores seleccionado o el diseño de secuenciación?

• ¿El proceso de bioinformática clasifica correctamente las muestras conocidas de MSI-H y MSS?

Sin estándares de referencia adecuados, es difícil evaluar si los resultados inesperados son causados ​​por la muestra, el diseño del ensayo, el instrumento, el lote de reactivo o el proceso de análisis de datos.

Características clave a buscar en un estándar de referencia MSI

Al seleccionar materiales de referencia de MSI, los laboratorios deben evaluar varias características importantes.

1. Estado de MSI claramente confirmado

El primer requisito es un estado MSI claramente definido.

Para la validación del ensayo MSI, los laboratorios normalmente necesitan materiales de referencia tanto positivos como negativos:

• Estándares de referencia MSI-H como controles positivos

• Estándares de referencia MSS como controles negativos o estables

Los materiales MSI-H ayudan a confirmar que el ensayo puede detectar la inestabilidad de microsatélites. Los materiales de MSS ayudan a verificar que el ensayo no clasifica incorrectamente muestras estables como inestables.

Para un flujo de trabajo de validación completo, no basta con utilizar únicamente materiales MSI-H. Los laboratorios también necesitan materiales MSS para evaluar la especificidad y la precisión de la clasificación.

2. Disponibilidad de ADNg normal y tumoral emparejado

El ADN genómico emparejado entre tumor y normal es muy útil para las pruebas de MSI porque muchos flujos de trabajo de MSI comparan el ADN del tumor con el ADN normal.

En los flujos de trabajo de PCR-CE, el ADN normal emparejado puede proporcionar una base para comparar el tamaño de los fragmentos. Esto ayuda a los laboratorios a identificar cambios específicos de tumores en los marcadores de microsatélites.

En los flujos de trabajo de NGS, los materiales emparejados con tumores normales pueden respaldar el desarrollo del flujo de trabajo, estrategias de comparación de tumores normales y verificación de tuberías.

Para los laboratorios que desean un modelo de validación más realista, el ADNg normal y tumoral emparejado es más informativo que los materiales de control individuales no emparejados.

3. Compatibilidad con flujos de trabajo PCR-CE

La PCR-CE sigue siendo un método ampliamente utilizado para la detección de MSI. Se basa en la amplificación por PCR de marcadores microsatélites seleccionados seguida de un análisis de fragmentos basado en electroforesis capilar.

Al elegir los estándares de referencia de MSI para PCR-CE, los laboratorios deben considerar si el material es compatible con los marcadores utilizados en su ensayo.

Los marcadores comunes de MSI incluyen:

• BAT-25

• BAT-26

• MONO-27

• NR-21

• NR-24

• NR-27

Los estándares de referencia con rendimiento conocido en estos marcadores pueden ayudar a los laboratorios a verificar la amplificación, el tamaño de los fragmentos, la inestabilidad del marcador y la clasificación de MSI.

Para los flujos de trabajo de PCR-CE, se pueden utilizar estándares de referencia adecuados para respaldar:

• Verificación del panel marcador

• Consistencia del análisis de fragmentos

• Clasificación MSI-H y MSS

• Reproducibilidad entre ejecuciones

• Formación de operadores

• Pruebas de control positivas y negativas de rutina

4. Compatibilidad con la detección de MSI basada en NGS

Las pruebas de MSI basadas en NGS son cada vez más comunes porque los laboratorios pueden integrar la detección de MSI en flujos de trabajo más amplios de elaboración de perfiles genómicos del cáncer.

Sin embargo, la detección de MSI basada en NGS depende de varios factores técnicos, entre ellos:

• Diseño de paneles

• Profundidad de secuenciación

• Cobertura del lugar de microsatélites

• calidad del ADN

• Fracción tumoral

• Preparación de la biblioteca

• Algoritmo de llamada MSI

• Configuración de umbral de bioinformática

Debido a esta complejidad, los flujos de trabajo de NGS requieren materiales de referencia cuidadosamente seleccionados.

Los estándares de referencia de MSI pueden ayudar a los laboratorios a evaluar si el flujo de trabajo completo de NGS, desde la entrada de ADN hasta la llamada final de MSI, puede clasificar correctamente muestras conocidas de MSI-H y MSS.

Para la validación del ensayo NGS, los estándares de referencia pueden admitir:

• Validación de panel dirigido

• Verificación del flujo de trabajo de secuenciación

• Evaluación del algoritmo MSI

• Pruebas de tuberías de bioinformática

• Comparación multiplataforma

• Monitoreo de calidad a largo plazo

5. Múltiples tipos de muestras para una cobertura de validación más amplia

Un conjunto sólido de estándares de referencia de MSI debería proporcionar más de una muestra positiva y una negativa. Múltiples muestras permiten a los laboratorios evaluar el rendimiento del ensayo en diferentes orígenes genéticos y fuentes de tumores.

Esto es útil porque la detección de MSI puede verse afectada por las características de la muestra, el origen del tumor, la calidad del ADN y el comportamiento del marcador.

Un conjunto de estándares de referencia con múltiples muestras de MSI-H y MSS permite a los laboratorios diseñar un estudio de validación más completo y evaluar mejor la solidez del flujo de trabajo.

Estándares de referencia CB-Gene MSI: 12 muestras pareadas para la validación de MSI

CB-Gene proporciona estándares de referencia MSI diseñados para la validación de ensayos MSI basados ​​en PCR-CE y NGS.

El conjunto de estándares de referencia CB-Gene MSI incluye 12 pares de materiales de referencia de ADN genómico. Cada par contiene una muestra de ADNg derivada de un tumor y una muestra de ADNg normal o de referencia correspondiente.

El conjunto de productos incluye:

Este diseño de 12 pares proporciona a los laboratorios materiales MSI-H y MSS para validación de ensayos, comparación de métodos y control de calidad.

El estado de MSI de estos estándares de referencia se confirma mediante el ensayo PCR-CE y el ensayo NGS, lo que los hace adecuados para laboratorios que trabajan con análisis de fragmentos o detección de MSI basada en secuenciación.

Cómo los estándares de referencia CB-Gene MSI respaldan la validación PCR-CE

Para los flujos de trabajo de PCR-CE, se pueden utilizar los estándares de referencia CB-Gene MSI para evaluar si el ensayo puede detectar los cambios esperados en los marcadores de microsatélites.

Los estándares son adecuados para el análisis PCR-CE MSI que involucra marcadores como BAT-25, BAT-26, MONO-27, NR-21, NR-24 y NR-27.

Los laboratorios pueden utilizar estos materiales para verificar:

• Rendimiento de amplificación por PCR

• Dimensionamiento de fragmentos de electroforesis capilar.

• Comparación tumor-normal

• Patrones de inestabilidad del marcador.

• Clasificación MSI-H

• clasificación MSS

• Consistencia entre ejecuciones

Debido a que el conjunto incluye muestras de MSI-H y MSS, puede admitir un diseño de validación más equilibrado que el uso de un único material de control.

Cómo los estándares de referencia CB-Gene MSI respaldan la validación de NGS

Para los flujos de trabajo NGS, los estándares de referencia CB-Gene MSI se pueden utilizar para evaluar el rendimiento tanto del laboratorio húmedo como del laboratorio seco.

En el proceso de laboratorio húmedo, los materiales pueden ayudar a evaluar la entrada de ADN, la preparación de la biblioteca, la calidad de la secuenciación y el rendimiento del panel.

En el proceso de laboratorio seco, los mismos materiales pueden ayudar a evaluar si el algoritmo de llamada de MSI clasifica correctamente muestras conocidas de MSI-H y MSS.

Estos estándares pueden respaldar actividades de validación de NGS tales como:

• Validación del panel de genes dirigidos

• Verificación del algoritmo de llamadas MSI

• Optimización del proceso de bioinformática

• Estudios de reproducibilidad entre ejecuciones.

• Comparación multiplataforma entre PCR-CE y NGS

• Control de calidad de rutina para la detección de MSI basada en secuenciación

Para los laboratorios que desarrollan detección de MSI basada en NGS, el uso de estándares de referencia confirmados tanto por PCR-CE como por NGS proporciona una capa adicional de confianza.

Diseño de validación sugerido utilizando estándares de referencia MSI

Un flujo de trabajo práctico de validación de MSI puede incluir los siguientes pasos.

Paso 1: Probar los estándares de referencia de MSS

Comience probando los materiales de MSS para confirmar que el ensayo no genera llamadas MSI-H falsas.

Este paso ayuda a evaluar la especificidad del ensayo y la estabilidad inicial.

Paso 2: Pruebe los estándares de referencia MSI-H

A continuación, pruebe los materiales MSI-H para confirmar que el ensayo puede detectar la inestabilidad de los microsatélites.

Este paso ayuda a evaluar la sensibilidad del ensayo y el rendimiento de clasificación positiva.

Paso 3: repetir en varias ejecuciones

Probar los mismos estándares de referencia en múltiples ejecuciones ayuda a evaluar la reproducibilidad.

Esto es útil para monitorear la variación causada por diferentes días, operadores, lotes de reactivos o instrumentos.

Paso 4: comparar los resultados de PCR-CE y NGS

Para los laboratorios que utilizan ambos métodos, se pueden utilizar los mismos materiales de referencia para comparar las clasificaciones PCR-CE y NGS.

Esto puede ayudar a respaldar los estudios de correlación de métodos y transición de plataformas.

Paso 5: Utilice estándares de referencia para el control de calidad de rutina

Después de la validación, los estándares de referencia de MSI pueden seguir utilizándose como controles positivos y negativos en programas de control de calidad de rutina.

Conclusión

Seleccionar el estándar de referencia MSI correcto es esencial para una validación confiable de los ensayos PCR-CE y NGS. Los laboratorios necesitan materiales MSI-H y MSS bien caracterizados para evaluar la precisión del ensayo, la reproducibilidad, el rendimiento de la clasificación y la estabilidad del flujo de trabajo.

Los estándares de referencia CB-Gene MSI proporcionan 12 materiales de referencia de ADN genómico emparejados, incluidos MSS-P1 a MSS-P4 y MSI-H-U1 a MSI-H-U8. Los estándares se confirman mediante ensayos PCR-CE y NGS y están diseñados para respaldar la validación de ensayos MSI, el control de calidad, la comparación de plataformas y la verificación de la tubería bioinformática.

Para los laboratorios y desarrolladores de diagnóstico que trabajan en pruebas de MSI, los estándares de referencia de MSI de CB-Gene ofrecen materiales de control prácticos para crear flujos de trabajo de detección de MSI confiables y reproducibles.

Comuníquese con CB-Gene para obtener más información sobre los estándares de referencia de MSI para la validación de ensayos PCR-CE y NGS.