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जीनोमिक डीएनए tTMB-P9 मानक कोबियो बायोटेक द्वारा विकसित एक विशेष मैट्रिक्स संदर्भ मानक है, जो कंपनी की व्यापक tTMB (टिशू ट्यूमर म्यूटेशन बर्डन) मानक श्रृंखला (tTMB-P1 से tTMB-P8 का पूरक) में 9वें उत्पाद के रूप में कार्य करता है। श्रृंखला में एकल-ट्यूमर-सामग्री मानकों के विपरीत, यह उत्पाद विशिष्ट रूप से नैदानिक ऊतक नमूनों की विविधता का अनुकरण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिसमें चार सटीक कैलिब्रेटेड ट्यूमर-सामान्य (टीएन) मिश्रण अनुपात शामिल हैं: 10% ट्यूमर (टी) + 90% सामान्य (एन), 5% टी + 95% एन, 2% टी + 98% एन, और 1% टी + 99% एन।
मानक उच्च-गुणवत्ता वाले जीनोमिक डीएनए (जीडीएनए) नमूनों से लिया गया है: ट्यूमर घटक चरण 4 फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा रोगी के ऊतक से अलग किया जाता है, जबकि सामान्य घटक उसी व्यक्ति के बी लिम्फोब्लास्ट से आता है - आनुवंशिक स्थिरता सुनिश्चित करता है और अंतर-व्यक्तिगत पृष्ठभूमि हस्तक्षेप को समाप्त करता है। सत्यापन के लिए, उत्पाद IDT xGenExome रिसर्च पैनल v1.0 का उपयोग करके 500× संपूर्ण-एक्सोम अनुक्रमण (WES) से गुजरता है, जो 39 एमबी कोडिंग क्षेत्र (सीडीएस क्षेत्र: 33.52 एमबी; जांच क्षेत्र: 51 एमबी) को लक्षित करता है और HiSeq X-TEN प्लेटफॉर्म पर अनुक्रमित होता है। अनुक्रमण के बाद, वेरिएंट को एलील फ्रीक्वेंसी (एएफ) कटऑफ के साथ 1% से 5% तक फ़िल्टर किया जाता है, जिससे प्रत्येक मिश्रण अनुपात के लिए विश्वसनीय टीएमबी मान उत्पन्न होता है (उदाहरण के लिए, 2% एएफ कटऑफ के साथ 10% टी पर 19.72 उत्परिवर्तन / एमबी, 2% एएफ कटऑफ के साथ 5% टी पर 10.5 उत्परिवर्तन / एमबी)।
इसका मुख्य कार्य एनजीएस-आधारित टीएमबी डिटेक्शन वर्कफ़्लो के लिए गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) में निहित है, विशेष रूप से यह मूल्यांकन करने पर ध्यान केंद्रित करना कि ट्यूमर सामग्री परिवर्तनशीलता टीएमबी माप सटीकता को कैसे प्रभावित करती है - नैदानिक अभ्यास में एक महत्वपूर्ण चुनौती जहां ऊतक के नमूनों में अक्सर कम या असमान ट्यूमर सेलुलरता होती है।
वास्तविक दुनिया के नैदानिक परिदृश्यों की नकल करता है जहां ऊतक के नमूनों में शायद ही कभी 100% ट्यूमर सामग्री होती है। 1%-10% ट्यूमर सामग्री ग्रेडिएंट सामान्य निम्न-से-मध्यम ट्यूमर अनुपात के मामलों (जैसे, उच्च स्ट्रोमल सामग्री के साथ सुई बायोप्सी नमूने) को कवर करता है, जिससे प्रयोगशालाएं नैदानिक रूप से प्रासंगिक परिस्थितियों में टीएमबी परख प्रदर्शन का परीक्षण कर सकती हैं।
एकल-ट्यूमर-सामग्री मानकों की सीमा को समाप्त करता है, जो यह प्रतिबिंबित नहीं कर सकता कि कम ट्यूमर सेलुलरता उत्परिवर्तन का पता लगाने की संवेदनशीलता को कैसे प्रभावित करती है।
1%-5% के बीच एएफ कटऑफ विश्लेषण का समर्थन करता है, जो टीएमबी गणना में एक प्रमुख पैरामीटर है। लैब्स अपने वर्कफ़्लो के लिए इष्टतम एएफ सीमा निर्धारित करने के लिए मानक का उपयोग कर सकते हैं और सत्यापित कर सकते हैं कि परख लगातार विभिन्न कटऑफ स्तरों पर उत्परिवर्तन का पता लगा सकती है या नहीं।
पता लगाने की सीमा (एलओडी) और संवेदनशीलता के मात्रात्मक मूल्यांकन को सक्षम करता है: उदाहरण के लिए, 1% टी + 99% एन अनुपात यह पहचानने में मदद करता है कि क्या एक परख बेहद कम ट्यूमर सामग्री (टीएमबी मूल्य: 0.95 उत्परिवर्तन / एमबी 2% एएफ कटऑफ पर) वाले नमूनों में टीएमबी को विश्वसनीय रूप से माप सकता है।
500× WES के माध्यम से मान्य, टीएमबी माप के लिए एक बेंचमार्क तकनीक, यह सुनिश्चित करती है कि मानक के टीएमबी मान सटीक और पता लगाने योग्य हैं। उपयोग किया गया IDT xGenExome पैनल सामान्य क्लिनिकल एक्सोम अनुक्रमण प्रोटोकॉल के साथ संरेखित होता है, जो लैब वर्कफ़्लो के साथ अनुकूलता बढ़ाता है।
यह सुनिश्चित करने के लिए कि क्लिनिकल टीएमबी विश्लेषण पाइपलाइनों से मेल खाते हुए, केवल उच्च-आत्मविश्वास वाले दैहिक उत्परिवर्तनों की गिनती की जाती है, सख्त पोस्ट-सीक्वेंसिंग फ़िल्टरिंग (उदाहरण के लिए, जर्मलाइन वेरिएंट, कम-गुणवत्ता वाले रीड्स को हटाना) से गुजरना पड़ता है।
इलुमिना-आधारित प्लेटफार्मों के लिए अनुकूलित (उदाहरण के लिए, हाईसेक एक्स-टीईएन, जैसा कि सत्यापन में उपयोग किया जाता है) और अन्य एनजीएस सिस्टम के साथ संगत है जो 39 एमबी कोडिंग क्षेत्र के एक्सोम या लक्षित पैनल अनुक्रमण का समर्थन करते हैं। मौजूदा वर्कफ़्लो में एकीकरण के लिए किसी अतिरिक्त प्रोटोकॉल संशोधन की आवश्यकता नहीं है।
नई टीटीएमबी डिटेक्शन किट के प्रदर्शन को मान्य करने के लिए किट निर्माताओं द्वारा उपयोग किया जाता है। विकास के दौरान, यह जांचने के लिए मानक को सामान्य जीडीएनए में बढ़ाया जा सकता है कि क्या किट विभिन्न ट्यूमर सामग्री स्तरों पर सटीकता बनाए रखती है (उदाहरण के लिए, यह पुष्टि करना कि किट 5% टी नमूनों में गलत निम्न के बिना टीएमबी को सही ढंग से माप सकता है)।
किट विनिर्देशों को निर्धारित करने में सहायता, जैसे विश्वसनीय परिणामों के लिए आवश्यक न्यूनतम ट्यूमर सामग्री को परिभाषित करना (उदाहरण के लिए, यह निर्धारित करने के लिए 2% टी अनुपात का उपयोग करना कि किट का एलओडी नैदानिक आवश्यकताओं को पूरा करता है या नहीं)।
क्लिनिकल लैब इन-हाउस टीएमबी परख की स्थिरता का आकलन करने के लिए मानक का उपयोग कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, प्रत्येक ट्यूमर सामग्री अनुपात पर टीएमबी मूल्यों की अंतर-रन प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता को सत्यापित करने के लिए कई रनों में tTMB-P9 के एक ही बैच का परीक्षण करना।
संवेदनशीलता या सटीकता में सुधार को मापने के लिए एक सुसंगत संदर्भ के रूप में मानक का उपयोग करके विभिन्न परख संस्करणों (उदाहरण के लिए, अद्यतन जांच पैनल या जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन) की तुलना का समर्थन करता है।
दैनिक टीएमबी परीक्षण में एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। एनजीएस वर्कफ़्लो (उदाहरण के लिए, डीएनए निष्कर्षण, लाइब्रेरी तैयारी, अनुक्रमण) ठीक से काम कर रहा है या नहीं, इसकी निगरानी के लिए लैब रोगी के नमूनों के साथ मानक चला सकते हैं - यदि मानक का टीएमबी मान संदर्भ सीमा से भटक जाता है, तो यह वर्कफ़्लो में संभावित त्रुटियों को इंगित करता है।
नियामक आवश्यकताओं के अनुपालन की सुविधा प्रदान करता है: मानक ट्रेस करने योग्य क्यूसी डेटा प्रदान करता है, जो टीएमबी परीक्षण के लिए नैदानिक प्रयोगशाला मान्यता मानकों (उदाहरण के लिए, सीएपी, सीएलआईए) को पूरा करने के लिए आवश्यक है।
टीटीएमबी-पी1 से टीटीएमबी-पी8 मानक निश्चित टीएमबी मूल्यों (5.37 से 27.15 म्यूटेशन/एमबी तक) के साथ एकल-ट्यूमर-सामग्री (100%टी) संदर्भ हैं, जो मुख्य रूप से टीएमबी मूल्य श्रेणियों को कैलिब्रेट करने और परख रैखिकता को सत्यापित करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। इसके विपरीत, टीटीएमबी-पी9 एक मैट्रिक्स मानक है जो ट्यूमर सामग्री परिवर्तनशीलता (1%-10%टी) पर केंद्रित है, जो इस मूल्यांकन को लक्षित करता है कि कम ट्यूमर सेलुलरता टीएमबी माप को कैसे प्रभावित करती है। दोनों प्रकार एक-दूसरे के पूरक हैं: P1-P8 सटीक TMB मान असाइनमेंट सुनिश्चित करता है, जबकि P9 विषम नैदानिक नमूनों में परख मजबूती सुनिश्चित करता है।
नहीं, tTMB-P9 मानक ऊतक नमूनों (gDNA) से जीनोमिक डीएनए के साथ तैयार किया गया है और विशेष रूप से ऊतक TMB (tTMB) परख QC के लिए डिज़ाइन किया गया है। रक्त टीएमबी (बीटीएमबी) परीक्षण के लिए, जो परिसंचारी ट्यूमर डीएनए (सीटीडीएनए) का उपयोग करता है, कोबियो बायोटेक समर्पित बीटीएमबी मानकों (उदाहरण के लिए, बीटीएमबी-पी 1) प्रदान करता है, जो सीटीडीएनए की अनूठी विशेषताओं (उदाहरण के लिए, कम एकाग्रता, विखंडन) के लिए अनुकूलित हैं। bTMB QC के लिए tTMB-P9 का उपयोग ctDNA-विशिष्ट वर्कफ़्लो के प्रदर्शन को प्रतिबिंबित नहीं करेगा।
जब -20°C (बार-बार जमने-पिघलने के चक्र से बचने) पर संग्रहीत किया जाता है, तो मानक प्राप्ति की तारीख से 12 महीने तक स्थिरता बनाए रखता है। अल्पकालिक उपयोग (1 महीने तक) के लिए, इसे 4°C पर संग्रहित किया जा सकता है। बार-बार फ्रीज-पिघलने से होने वाले क्षरण को रोकने के लिए प्राप्ति पर मानक को छोटी मात्रा में विभाजित करने की सिफारिश की जाती है।
1%T + 99%N अनुपात TMB परीक्षण के लिए सबसे चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि इसमें ट्यूमर-व्युत्पन्न उत्परिवर्तन का स्तर बेहद कम होता है। एक विश्वसनीय परख को संदर्भ के करीब टीएमबी मान का पता लगाना चाहिए (2% एएफ कटऑफ पर 0.95 उत्परिवर्तन/एमबी)। यदि मापा गया टीएमबी संदर्भ से काफी कम है, तो यह इंगित करता है कि परख में कम ट्यूमर-सामग्री वाले नमूनों के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता की कमी हो सकती है। यदि मान अधिक है, तो यह गलत-सकारात्मक वैरिएंट कॉल (उदाहरण के लिए, सामान्य सेल उत्परिवर्तन या अनुक्रमण त्रुटियों से) का सुझाव दे सकता है, जिसके लिए जैव सूचना विज्ञान फ़िल्टर के अनुकूलन की आवश्यकता होती है।
tTMB-P9 मानक का प्रत्येक बैच TMB मान स्थिरता (संदर्भ सीमा से भिन्नता ≤ 5%) की पुष्टि करने के लिए डुप्लिकेट WES सत्यापन से गुजरता है। इसके अतिरिक्त, हम डीएनए अखंडता (एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके) और शुद्धता (ए260/ए280 अनुपात 1.8-2.0) का परीक्षण करते हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि मानक उच्च गुणवत्ता वाली जीडीएनए आवश्यकताओं को पूरा करता है - जो विश्वसनीय एनजीएस प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण है।
1%-10% ट्यूमर सामग्री ग्रेडिएंट हजारों नैदानिक ऊतक नमूनों के विश्लेषण पर आधारित है, जो प्रयोगशालाओं में आने वाली सबसे आम समस्या को संबोधित करता है: कम-ट्यूमर-सामग्री बायोप्सी से गलत टीएमबी परिणाम। इस मानक का उपयोग करके, प्रयोगशालाएँ रोगी के परीक्षण परिणामों को प्रभावित करने से पहले सक्रिय रूप से वर्कफ़्लो सीमाओं की पहचान और समाधान कर सकती हैं।
हम सभी ट्यूमर सामग्री अनुपात और एएफ कटऑफ के लिए संदर्भ टीएमबी मूल्यों के साथ एक विस्तृत तकनीकी डेटाशीट प्रदान करते हैं, साथ ही क्यूसी में मानक का उपयोग करने के लिए एक अनुशंसित वर्कफ़्लो भी प्रदान करते हैं। जैव सूचना विज्ञान और आणविक जीव विज्ञान विशेषज्ञों की हमारी टीम डेटा व्याख्या, परख अनुकूलन और समस्या निवारण में सहायता के लिए भी उपलब्ध है - यह सुनिश्चित करते हुए कि प्रयोगशालाओं को उत्पाद से सबसे अधिक मूल्य मिले।
tTMB-P9 मानक इन विट्रो डायग्नोस्टिक (IVD) QC मानकों (जैसे, FDA, NMPA) के लिए वैश्विक नियामक दिशानिर्देशों के अनुरूप विकसित किया गया है। इसका उपयोग एनएमपीए-अनुमोदित टीएमबी डिटेक्शन किट (उदाहरण के लिए, गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर टीएमबी किट) के विकास का समर्थन करने के लिए किया गया है, जो नियामक-अनुपालक नैदानिक वर्कफ़्लो के लिए इसकी उपयुक्तता को प्रदर्शित करता है।
नाम |
tTMB-P9(मैट्रिक्स) संदर्भ मानक |
बिल्ली। नहीं। |
सीबीपी80001-9 |
प्रारूप |
जीनोमिक डीएनए |
आकार |
1ug+1ug |
माल सूची स्थिति |
स्टॉक में |
बफर |
ट्रिस-ईडीटीए |
जमा करने की अवस्था |
2~8℃ |
समाप्ति |
निर्माण की तारीख से 36 महीने |
नमूना आईडी |
विवरण |
कटऑफ=1% |
कटऑफ=2% |
कटऑफ=3% |
कटऑफ=4% |
कटऑफ=5% |
DC208D0421 |
10%टी+90%एन |
22.94 |
19.72 |
16.53 |
12.50 |
8.41 |
DC208D0422 |
5%टी+95%एन |
15.75 |
10.50 |
5.82 |
2.92 |
1.37 |
DC208D0423 |
2%T+98%N |
8.29 |
2.12 |
0.75 |
0.42 |
0.21 |
DC208D0424 |
1%टी+99%एन |
4.15 |
0.95 |
0.27 |
0.18 |
0.09 |
500xWES; IDT xGenExome रिसर्च पैनल v1.0कैप्चर, लक्ष्य क्षेत्र 39एम, जांच क्षेत्र 51एम; HiSeq X-TEN, 0.01 कट ऑफ चुनें, म्यूटेशन को कॉल करें, फिर से फ़िल्टर करें, और फिर ग्रेडिएंट कट ऑफ के अनुसार टीएमबी की गणना करें। ट्यूमर का नमूना: चरण 4, एडेनोकार्सिनोमा फेफड़े, महिला सामान्य नमूना: एक ही व्यक्ति से बी लिम्फोब्लास्ट |
||||||
बिल्ली.सं. |
पहचान |
टीएमबी मूल्य |
तरीका |
सीबीपी80001-1 |
tTMB-P1 |
5.37 |
वेस |
सीबीपी80001-2 |
tTMB-P2 |
9.84 |
वेस |
सीबीपी80001-3 |
tTMB-P3 |
12.41 |
वेस |
सीबीपी80001-4 |
tTMB-P4 |
21.09 |
वेस |
सीबीपी80001-5 |
tTMB-P5 |
27.15 |
वेस |
सीबीपी80001-6 |
tTMB-P6 |
8.98 |
वेस |
सीबीपी80001-7 |
tTMB-P7 |
6.83 |
वेस |
सीबीपी80001-8 |
tTMB-P8 |
27.15 |
वेस |
सीबीपी80001-10 |
bTMB-P1 |
22.91 |
वेस |
